胍丁胺在內(nèi)毒素性肺損傷中的治療作用和抗氧化機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:急性呼吸窘迫綜合征ARDS（acute respiratory distress syndrome）是由過(guò)度炎癥引起的一種急性、彌漫性肺損傷，主要臨床表現(xiàn)為低氧血癥、急性或進(jìn)展性呼吸困難和非心源性肺水腫。4年前制定的國(guó)際新標(biāo)準(zhǔn)已取消了ALI/ARDS的概念，而把此病統(tǒng)一稱(chēng)作ARDS。作為一種死亡率居高不下的臨床危重癥疾病，該病的預(yù)防和治療研究一直備受重視。近年來(lái)，雖然在藥物療法、保護(hù)性機(jī)械通氣以及氣道管理等方面取得了一些進(jìn)展，

2、但因其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，疾病的最終治療效果并無(wú)顯著改善。
　　氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肺部過(guò)度炎癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)聯(lián)機(jī)制，由其所介導(dǎo)的組織損傷是ARDS病變過(guò)程中的重要事件，而肺組織中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是ARDS時(shí)肺內(nèi)活性氧ROS（Reactiveoxygenspecies）產(chǎn)生的最主要來(lái)源。胍丁胺（agmatine，AGM）是由精氨酸脫羧形成的生物胺，經(jīng)前期研究證實(shí)，在脂多糖（LPS）引導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征實(shí)驗(yàn)中，胍丁胺可以

3、發(fā)揮抗炎效應(yīng)并顯著提高生存率。在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目圍繞―胍丁胺可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞過(guò)度氧化反應(yīng)從而在內(nèi)毒素性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用‖的設(shè)想，研究胍丁胺對(duì)LPS所致大鼠ARDS的保護(hù)作用，以PI3K/Akt、Nrf2/HO-1信號(hào)通路為對(duì)象，研究胍丁胺影響巨噬細(xì)胞ROS生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并進(jìn)一步明確了HO-1終產(chǎn)物膽紅素（bilirubin）是否參與胍丁胺的抗氧化功能。旨在明確胍丁胺針對(duì)內(nèi)毒素肺損傷所發(fā)揮治療和保護(hù)效應(yīng)的機(jī)理，同時(shí)為深入認(rèn)識(shí)

4、體內(nèi)內(nèi)源性生物胺參與外周抗炎作用與調(diào)控機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)，為探尋利用機(jī)體自身生物學(xué)物質(zhì)、改善ARDS治療提供新思路。
　　材料與方法:
　　（1）胍丁胺對(duì) LPS誘導(dǎo)的大鼠ARDS的治療保護(hù)作用。采用氣管內(nèi)注射法給藥建模。將100只雄性SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、LPS組、AGM治療組和AGM組，每組25只。第一次給藥：對(duì)照組給予生理鹽水0.1ml， LPS組給予3mg/kg LPS0.1ml，AGM治療組給予3mg/

5、kg LPS0.1ml，AGM組給予5mg/kg AGM0.1ml；30分鐘后第二次給藥：對(duì)照組、LPS組和AGM組皆給予生理鹽水0.1ml， AGM治療組給予5mg/kg AGM0.1ml。每組隨機(jī)選取10只，通過(guò)觀察4日存活率來(lái)評(píng)估AGM對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征大鼠的治療保護(hù)作用。每組隨機(jī)抽取5只動(dòng)物行鼠尾靜脈熒光標(biāo)記物注射。其余動(dòng)物于給藥后24小時(shí)處死采集肺組織標(biāo)本。通過(guò)比較肺泡灌洗液（BALF）和肺組織中炎癥因子表達(dá)水平

6、以及中性粒細(xì)胞MPO水平來(lái)評(píng)估肺部炎癥變化情況；采用肺濕/干測(cè)定以及FITC-BSA熒光標(biāo)記法來(lái)評(píng)估通透性改變；通過(guò)肺組織HE染色觀察組織損傷改變；通過(guò)檢測(cè)肺組織抗氧化酶SOD活性和脂質(zhì)氧化（MDA）含量以及Western blot方法檢測(cè)HO-1表達(dá)來(lái)評(píng)估氧化應(yīng)激水平的變化。
　?。?）以RAW264.7細(xì)胞為模型探討AGM在LPS誘導(dǎo)的過(guò)度氧化反應(yīng)中的抗氧化作用。MTT法檢測(cè)存活率并選擇適合的給藥濃度。采用治療性給藥使胍丁胺作

7、用于經(jīng)LPS刺激活化的RAW264.7細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞蛋白?；瘜W(xué)比色法檢測(cè) SOD活性與 MDA含量；Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中 NO的表達(dá)；采用DCFH-DA熒光探針標(biāo)記活細(xì)胞測(cè)量其生成 ROS的狀況；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中iNOS蛋白的含量。
　?。?）AGM在LPS誘導(dǎo)活化的RAW264.7細(xì)胞中抗氧化作用的機(jī)制研究。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)α2腎上腺素能受體（α2-adrenoce

8、ptor）和咪唑啉受體（imidazoline receptor）I1R、I2R在AGM抗氧化調(diào)節(jié)中對(duì)HO-1表達(dá)的影響；用Western blot法檢測(cè)總AKt和磷酸化AKt的變化，觀察AKt抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，PI3K/Akt下游Nrf2活性和HO-1mRNA表達(dá)的變化以及ROS生成的情況；用WB方法測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在胞漿和胞核內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)合EMSA測(cè)定入核的Nrf2的DNA結(jié)合力；利用Zn

9、PP阻斷HO-1通路，明確AGM的抗氧化功能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路的密切程度；并通過(guò)胍丁胺量效測(cè)定 HO-1催化終產(chǎn)物膽紅素（bilirubin）的變化以及對(duì)NO生成的影響，明確HO-1催化終產(chǎn)物與AGM的抗氧化作用的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）治療性地由氣管內(nèi)給予 AGM使 ARDS模型大鼠4日存活率顯著上升；AGM治療組BALF與組織中TNF-α和IL6含量明顯減少；肺泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)損傷減輕，肺濕/干、MPO活性、M

10、DA含量皆顯著下降，F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光蛋白進(jìn)入肺內(nèi)的量明顯降低；肺內(nèi)SOD活性和HO-1表達(dá)水平顯著增加。
　　（2）LPS刺激導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞iNOS蛋白的含量升高，ROS和NO大量生成，給予AGM治療可顯著緩解LPS所致ROS和NO生成，提高SOD活性。
　?。?）與LPS組相比，AGM治療可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)AKt磷酸化水平，Nrf2入核明顯增加，核內(nèi)Nrf2的DNA結(jié)合活力明顯增強(qiáng)，HO-1表達(dá)顯著提高，ROS生成

11、明顯降低；LY294002和ZnPP都可以消除AGM對(duì)ROS的緩解作用；HO-1的催化終產(chǎn)物與AGM呈劑量依賴(lài)性變化；應(yīng)用相應(yīng)阻斷劑阻斷α2腎上腺素能和咪唑啉I1R、I2R不影響AGM所致HO-1水平變化。
　　結(jié)論：
　?。?）胍丁胺能夠緩解 LPS所致大鼠肺水腫，改善通透性，減輕過(guò)度炎癥，提高生存率，對(duì)ARDS具有治療保護(hù)效應(yīng)。
　?。?）胍丁胺能夠減輕巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放，增強(qiáng)抗氧化酶SOD活性，降低ROS和NO