厄貝沙坦對AGEs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、近年來，中國的糖尿病患病率在迅速增長，其造成的糖尿病相關(guān)性骨質(zhì)疏松，可使骨折等并發(fā)癥顯著升高，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的健康和生活質(zhì)量。既往研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病中，晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的形成和積累加速，是導(dǎo)致多種糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生的原因，AGEs在糖尿病性骨質(zhì)疏松中亦起者重要作用。使用有效的干預(yù)途徑抑制AGEs的對成骨的損傷，改善骨形成，為臨床防治糖尿病性骨質(zhì)疏松提供理

2、論根據(jù)和有效的方法。
　　本課題擬以成骨細(xì)胞為研究對象，觀察厄貝沙坦對AGEs誘導(dǎo)下的成骨細(xì)胞增殖、凋亡、成骨分化、氧化應(yīng)激、RAGE表達(dá)等方面的影響。進(jìn)而明確厄貝沙坦能否通過阻斷AGEs-RAGE的作用預(yù)防或治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥。
　　本研究分為以下兩部分:
　　第一部分 AGEs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷
　　目的：
　　本部分實驗以成骨細(xì)胞為研究對象，采用不同濃度及作用時間的AGEs對成骨細(xì)胞進(jìn)行處理，篩選出A

3、GEs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的合適的作用濃度及時間。
　　方法：
　　1、成骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　采用顱骨溶解法，分離新生SD大鼠的成骨細(xì)胞，并通過傳代進(jìn)行純化，置于5％CO2、飽和濕度、37℃孵箱中培養(yǎng)。
　　2、實驗分組
　　探討不同濃度AGEs對成骨細(xì)胞增殖的影響時，分為正常對照組、BSA組、AGEs組（50、100、200、400μg/ml），分別作用于細(xì)胞3d。探討AGEs作用不同時間對成骨細(xì)胞增殖的

4、影響時，分為空白對照組、1d、3d、5d、7d、9d組，以100μg/mlAGEs作用于細(xì)胞。
　　3、采用CCK-8法檢測不同濃度、不同作用時間AGEs對成骨細(xì)胞增殖的影響。
　　統(tǒng)計學(xué)處理
　　計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行，方差齊時，多樣本比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗，組間兩兩比較采用LSD檢驗;方差不齊時，用校正welch檢驗，組間

5、兩兩比較采用Dunnett T3法。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度的AGEs對成骨細(xì)胞增殖的影響
　　50、100、200、400μg/ml AGEs作用成骨細(xì)胞3d后，AGEs組的OD值與空白對照組及BSA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中100μg/ml AGEs組細(xì)胞的OD值與50μg/ml AGEs組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、AGEs作用不同

6、時間對成骨細(xì)胞增殖的影響
　　100μg/ml AGEs分別作用成骨細(xì)胞1d、3d、5d、7d、9d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3d組細(xì)胞的OD值與空白對照組、BSA組及其他作用時間組相比明顯降低，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　篩選出AGEs抑制成骨細(xì)胞增殖合適的濃度為100μg/ml，作用時間為3d。
　　第二部分 厄貝沙坦對AGEs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的影響
　　目的：
　　用厄貝沙坦與AGEs聯(lián)

7、合處理成骨細(xì)胞，觀察厄貝沙坦對AGEs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的影響。
　　方法：
　　1、成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)同上。
　　2、成骨細(xì)胞的增殖、凋亡:MTT法檢測成骨細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞儀測定細(xì)細(xì)胞凋亡率、胞生長周期、JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位。
　　3、成骨細(xì)胞分化檢測:鈣化結(jié)節(jié)染色，RT-PCR法檢測成骨分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況。
　　4、氧化應(yīng)激的檢測:熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)氧活性。
　　5、RAGE

8、表達(dá)情況:Quantitation RT-PCR法檢測RAGE的mRNA表達(dá)情況。
　　統(tǒng)計學(xué)處理
　　同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1、AGEs組成骨細(xì)胞活力減低，細(xì)胞增殖能力下降，聯(lián)合厄貝沙坦處理組成骨細(xì)胞增殖較AGEs組改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、AGEs作用于成骨細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，聯(lián)合厄貝沙坦處理組G1期及S期的細(xì)胞比例較AGEs組減少。
　　3、與AGES組相比，

9、聯(lián)合厄貝沙坦處理組能顯著減少成骨細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4、AGEs造成成骨細(xì)胞線粒體膜電位下降。熒光顯微鏡下觀察到AGEs組紅色熒光減少，綠色熒光增加，聯(lián)合厄貝沙坦處理組，能夠改變上述趨勢。
　　5、采用茜素紅染色，與正常對照組及BSA組相比，AGEs處理組幾乎看不到被染成深紅色的鈣結(jié)節(jié)，聯(lián)合厄貝沙坦處理組，細(xì)胞外可以見到被茜素紅染成深紅色的鈣結(jié)節(jié)。
　　6、AGEs組能顯著抑制成骨細(xì)胞中

10、ALP、CollagenⅠ、RUNX2的表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而聯(lián)合厄貝沙坦處理組，ALP、RUNX2的表達(dá)與AGEs組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，CollagenⅠ的表達(dá)與AGEs組相比具有顯著差異(P＜0.01)。
　　7、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，AGEs組細(xì)胞的熒光強度與空白對照組相比明顯增強，而聯(lián)合厄貝沙坦處理組細(xì)胞的熒光強度比AGEs組顯著降低。
　　8、AGEs組能顯著增加

11、成骨細(xì)胞中RAGE mRNA的表達(dá)，與空白對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。聯(lián)合厄貝沙坦處理后，RAGE mRNA的表達(dá)較AGEs組顯著下調(diào)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　本實驗證實厄貝沙坦對AGEs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。厄貝沙坦可下調(diào)RAGE的表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，在一定程度上能夠改善AGEs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的損傷，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，減少其凋亡，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分