家蠅抗菌肽的分離純化及抗菌活性、機(jī)理研究.pdf

1、昆蟲(chóng)抗菌肽足昆蟲(chóng)免疫防御系統(tǒng)的重要成分，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣等特點(diǎn)。家蠅存在獨(dú)特的免疫機(jī)制，在我國(guó)分布廣，資源豐富，容易養(yǎng)殖、成本低，是一個(gè)等待開(kāi)發(fā)的良好資源。因此對(duì)家蠅抗菌肽的研究具有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 本研究以三齡家蠅幼蟲(chóng)為材料用不同的細(xì)菌分別進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)抗菌活性測(cè)定、毛細(xì)管電泳技術(shù)與SDS-PAGE分析不同微生物誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)產(chǎn)生表達(dá)抗菌肽的差異，結(jié)果表明：家蠅幼蟲(chóng)對(duì)于不同細(xì)菌侵染存在特異性的

2、免疫應(yīng)答反應(yīng)，不同的細(xì)菌可以誘導(dǎo)不同的抗菌肽。 選擇抗菌活性強(qiáng)的志賀氏菌誘導(dǎo)的樣品為材料，通過(guò)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾層析、RP-HPLC分離、氨基酸組成分析與MALDI-TOF/TOF-MS等手段分離純化、鑒定得到一種與 hexamerin L1(其相對(duì)分子質(zhì)量為96.52×10<'3>)序列同源、本對(duì)分子質(zhì)量為19，041.0的新的家蠅抗菌肽，將其定名為Hf-1。 對(duì)家蠅抗菌肽Hf-1的抗菌活性檢測(cè)農(nóng)明：家

3、蠅抗菌肽Hf-1對(duì)病原菌大腸桿菌、志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、枯草桿菌9372與金黃色葡萄球菌及工程菌大腸桿菌JM109均有抗菌活性：對(duì)乳酸與真菌沒(méi)有抗菌活性。抗菌肽Hf-1在純牛奶(pH6.8)與新鮮橘子汁(最終pH 3.2)中均具有抗菌活性，表明家蠅抗菌肽Hf-1具有潛力作為食品防腐劑使用。 利用細(xì)菌吸附十六烷(MATS)方法、電泳儀測(cè)量細(xì)菌電泳運(yùn)動(dòng)率、測(cè)定A<,630nm>的變化與細(xì)菌細(xì)胞膜上β-半乳糖苷酶滲透性，

4、分別探索了家蠅抗菌肽Hf-1對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性、細(xì)胞表面電荷、細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜的作剛，并與抗菌肽加MgCl<,2>的作用相對(duì)照，初步揭示了家蠅抗菌肽Hf-1的作用機(jī)制：抗菌肽首先與細(xì)菌接觸，使細(xì)菌表面電負(fù)性增強(qiáng)，細(xì)胞表面疏水性下降，利于抗菌肽進(jìn)一步與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合?？咕膶?dǎo)致細(xì)胞壁的滲透性增加?？咕腍f-1對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的作用方式為“形成孔洞機(jī)制”，使原生質(zhì)擴(kuò)散，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 通過(guò)紫外檢測(cè)，表明抗菌肽Hf-1進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)菌

5、的染色體DNA、RNA、核苷酸等紫外吸收物質(zhì)相互作用，使之漏出?？咕腍f-1對(duì)細(xì)菌DNA作用的紫外光譜和熒光光譜表明，家蠅抗菌肽Hf-1與細(xì)菌DNA的作用方式為：首先陽(yáng)離子抗菌肽與大腸桿菌DNA骨架通過(guò)靜電引力結(jié)合，然后抗菌肽以部分嵌入方式與外在結(jié)合DNA分子內(nèi)帶負(fù)電的磷酸根骨架方式與DNA相互作用。并首次利用McGhee-von Hippe公式結(jié)合熒光滴定分析定量描述了抗菌肽與DNA的相互作用方式，計(jì)算得到抗菌肽與DNA結(jié)合常數(shù)K=