重組質(zhì)粒DNA的規(guī)?；a(chǎn)工藝及質(zhì)量鑒定研究.pdf

1、用于質(zhì)粒DNA規(guī)?；a(chǎn)的大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 為降低質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)成本，在標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用國(guó)產(chǎn)試劑配制成十種大腸桿菌液體培養(yǎng)基，以pEGFPC3、pcDNAlacZ和pcDNKLYZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的JM109和DH5α大腸桿菌為指示菌進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，定時(shí)采樣測(cè)量OD600值及質(zhì)粒產(chǎn)量，獲得一種高性價(jià)比培養(yǎng)基。用該培養(yǎng)基培養(yǎng)重組大腸肝菌，繪制生長(zhǎng)曲線，并于其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期進(jìn)行42℃誘導(dǎo)。結(jié)果表明經(jīng)42℃誘導(dǎo)后，重

2、組大腸肝菌JM109和DH5α的質(zhì)粒產(chǎn)量均有提高，重組JM109的產(chǎn)量比重組DH5α約提高20％，為低成本、大規(guī)模生產(chǎn)重組質(zhì)粒提供了良好的技術(shù)保障。 重組大腸桿菌連續(xù)傳代及高密度發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性 在重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，由于質(zhì)粒復(fù)制及分配的不穩(wěn)定性有可能導(dǎo)致重組菌質(zhì)粒的丟失和產(chǎn)量下降。本研究以重組質(zhì)粒pcDNKLYZ轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌為指示細(xì)菌，以M5為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以批次發(fā)酵和

3、補(bǔ)料發(fā)酵控制細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，研究重組菌發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性以及細(xì)菌生長(zhǎng)速率和質(zhì)粒復(fù)制的關(guān)系。結(jié)果表明，補(bǔ)料發(fā)酵8h后重組菌的密度可達(dá)到OD600=30，質(zhì)粒產(chǎn)量可達(dá)到30mg/L，質(zhì)粒丟失率從批次發(fā)酵的5.88％下降到0.63％，該策略可用于重組質(zhì)粒的大規(guī)模生產(chǎn)。 重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵放大工藝研究 在初步篩選獲得性價(jià)比較好的大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以表達(dá)溶菌酶基因的pcDNKLYZ重組質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α為模型，用150L發(fā)酵罐進(jìn)行工藝放大研究，通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)密度(OD600值)和質(zhì)粒產(chǎn)量的測(cè)定，比較添加甘油或葡萄糖的國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基與進(jìn)口培養(yǎng)基發(fā)酵能力的差異。結(jié)果顯示在國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基中添加1％甘油、磷酸鹽和硫酸鹽后，重組菌的生長(zhǎng)密度和質(zhì)粒產(chǎn)量均與進(jìn)口的LB培養(yǎng)基接近或略高。將發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)流式離心機(jī)收集的菌體于-70℃和-20℃保存，質(zhì)粒提取和定量檢測(cè)結(jié)果顯示保存6周后質(zhì)粒產(chǎn)量無(wú)明顯變化。用不同體積的溶液Ⅰ懸浮重組菌，質(zhì)粒提取

5、和定量檢測(cè)結(jié)果顯示每克濕菌用5mL溶液Ⅰ懸浮，可以獲得較高的質(zhì)粒產(chǎn)量。 重組大腸桿菌堿裂解方法的改進(jìn) 重組菌的堿裂解是質(zhì)粒DNA制備的關(guān)鍵一步，其所用溶液一般由價(jià)格昂貴的進(jìn)口試劑配制，成本較高。為了進(jìn)一步降低質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)成本，本研究對(duì)經(jīng)典的堿裂解法進(jìn)行了改進(jìn)，以表達(dá)溶菌酶基因的pcDNKLYZ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α為指示菌，以標(biāo)準(zhǔn)堿裂解和改進(jìn)堿裂解法提取質(zhì)粒DNApcDNKLYZ，以提取的質(zhì)粒產(chǎn)量和

6、質(zhì)量為指標(biāo)，判斷優(yōu)化堿性裂解法的性價(jià)比。結(jié)果顯示，用優(yōu)化后的堿裂解法裂解重組菌，提取的pcDNKLYZ質(zhì)粒產(chǎn)量等指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)方法接近，而成本僅為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/4，可用于重組質(zhì)粒的大規(guī)模制備。 CTAB選擇性沉淀質(zhì)粒DNA方法的改進(jìn)及其純化質(zhì)粒的質(zhì)量檢驗(yàn) 重組質(zhì)粒的純化是制約核酸疫苗和基因藥物在獸醫(yī)臨床使用的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，現(xiàn)有的質(zhì)粒純化方法都有制備規(guī)模小、使用有毒物質(zhì)或成本高等缺點(diǎn)。本研究在公開發(fā)表的十六烷基三甲

7、基溴化銨(CTAB)選擇性沉淀質(zhì)粒DNA的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)CTAB用量及其與質(zhì)粒DNA比例的進(jìn)一步優(yōu)化、質(zhì)粒DNA選擇性釋放和內(nèi)毒素去除劑的使用，建立了簡(jiǎn)單、易行的大規(guī)模質(zhì)粒DNA純化方法。純化質(zhì)粒DNA的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，將適當(dāng)濃度和比例的CTAB與堿裂解后的菌體裂解物離心上清混合，可使絕大部分菌體RNA和蛋白保留在離心上清中，再經(jīng)質(zhì)粒DNA選擇釋放和內(nèi)毒素去除等處理后，質(zhì)粒DNA中檢測(cè)不到菌體RNA，菌體基因組DNA、內(nèi)毒素和蛋白含量

8、分別小于100ng/mg、50EU/mg和7μg/mg質(zhì)粒DNA，OD260/OD280比值介于1.75-1.85之間，超螺旋質(zhì)粒的比例大于80％。 改良CTAB選擇沉淀法純化質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 為了進(jìn)一步鑒定用改良CTAB沉淀法純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量及可能存在的細(xì)胞毒性，將用CTAB沉淀法和商品化試劑盒純化的質(zhì)粒pEGFPN1與脂質(zhì)體(lipofection2000)或聚乙烯亞胺(PEI)包裹，分別轉(zhuǎn)染CO

9、S-7、MDCK和Marc145真核細(xì)胞，24h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果表明，兩種方法純化的質(zhì)粒DNA對(duì)3種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，PEI包裹質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比lipofection2000略高，進(jìn)一步表明用改良CTAB沉淀法可以純化獲得質(zhì)量較高的重組質(zhì)粒，可用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)。 改良CTAB選擇沉淀法純化質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)研究 為了進(jìn)一步驗(yàn)證用改良CTAB沉淀法純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，分別用商品化試劑盒(E

10、ndoFreePlasmidKit)和改良CTAB沉淀法純化表達(dá)lacZ基因的重組質(zhì)粒pcDNAlacZ，經(jīng)PEI包裹后尾靜脈注射小鼠，注射后每隔2天撲殺小鼠，取其心、肝、脾、肺、腎等組織，用試劑盒定量檢測(cè)β-半乳糖苷酶的表達(dá)和持續(xù)時(shí)間。結(jié)果顯示報(bào)告基因僅在重組載體注射小鼠的心、脾和肝組織中表達(dá)，兩種方法純化質(zhì)粒的表達(dá)水平接近，注射后第4天重組酶的表達(dá)量最高，8天后組織中的重組酶活性降至很低水平，10天后檢測(cè)不到酶活性。

11、 純化質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)的分布、殘留及水平傳播 為了進(jìn)一步驗(yàn)證改良CTAB沉淀法純化的重組質(zhì)粒的體內(nèi)使用效果，通過(guò)肌肉注射途徑用含3拷貝CpG序列的重組質(zhì)粒pcDNKCpG注射雞和豬，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的臨床觀察、質(zhì)粒DNA在動(dòng)物組織中的分布及殘留檢測(cè)、動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中的水平傳播檢測(cè)，研究純化質(zhì)粒的生物安全性。高靈敏PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，1次注射150μg(雞)和500μg(豬)pcDNKCpG后，重組質(zhì)粒主要分布于血液和肌肉注射部位，

12、殘留時(shí)間分別不超過(guò)16天和8天；用地高辛標(biāo)記的特異探針進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果未能檢測(cè)到重組質(zhì)粒與宿主基因組的整合；從試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中采集細(xì)菌樣本，用CpG特異引物對(duì)從細(xì)菌培養(yǎng)物提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果未檢測(cè)到重組質(zhì)粒在動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中水平傳播。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，用改良CTAB法純化的重組質(zhì)粒具有良好的生物安全性，可以用于動(dòng)物臨床試驗(yàn)。 重組質(zhì)粒DNA的規(guī)?；a(chǎn)工藝及質(zhì)量鑒定研究 基因治療和基因免

13、疫是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，其中以表達(dá)目的基因重組質(zhì)粒為基礎(chǔ)的非病毒基因轉(zhuǎn)移策略具有安全性好等突出優(yōu)點(diǎn)，更加受到研究者的青睞。目前實(shí)驗(yàn)室制備重組質(zhì)粒DNA不僅技術(shù)較為成熟，而且有眾多的商品化試劑盒可供選用，但這些試劑盒不僅價(jià)格昂貴，而且不能滿足大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA的需要。大規(guī)模制備既符合相關(guān)質(zhì)量要求，價(jià)格又便宜的重組質(zhì)粒DNA，特別是動(dòng)物用重組質(zhì)粒DNA，仍是制約核酸疫苗和基因治療研究的瓶頸。 規(guī)?；a(chǎn)重組質(zhì)粒

14、DNA的另一重要環(huán)節(jié)是重組菌的破碎處理和質(zhì)粒DNA的純化。本研究對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的重組大腸桿菌堿溶解法進(jìn)行了改進(jìn)，使其在不影響質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量的前提下，制備成本明顯下降。該方法不僅具有容易放大和制備成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且制備的質(zhì)粒DNA質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到或接近WHO規(guī)定的人基因治療/基因免疫用重組質(zhì)粒DNA的要求，具體表現(xiàn)為：純化質(zhì)粒DNA無(wú)菌體RNA污染，宿主菌基因組DNA含量小于10ng/μg質(zhì)粒DNA，內(nèi)毒素含量小于50EU/mg質(zhì)粒DNA，雜蛋白含量

15、小于10μg/mg質(zhì)粒DNA，OD260/OD280比值在1.75-1.85之間，超螺旋質(zhì)粒比例大于80％。 用上述建立的方法制備表達(dá)綠色熒光蛋白基因的pEGFPN1質(zhì)粒，分別用脂質(zhì)體和聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)包裹，分別轉(zhuǎn)染COS-7、MDCK和Marc145等真核細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，用改良型CTAB沉淀法制備的重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率與商品化試劑盒相當(dāng)；PEI包裹質(zhì)粒在COS-7和M

16、DCK細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于lipfection2000，而lipfection2000包裹質(zhì)粒在Marc-145細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于PEI包裹質(zhì)粒；用改良型CTAB沉淀法純化的表達(dá)β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的pcDNAlacZ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用X-gal染色法能檢測(cè)到β-半乳糖苷酶的表達(dá)；將改良型CTAB沉淀法和EndoFreePlasmidKit純化的pcDNAlacZ質(zhì)粒用PEI包裹，經(jīng)尾靜脈注射小鼠，β-半乳糖苷酶表達(dá)、分布和

17、持續(xù)時(shí)間檢測(cè)結(jié)果顯示，重組載體在注射小鼠的心、脾和肝組織中表達(dá)，兩種方法純化質(zhì)粒的表達(dá)效果相當(dāng)，注射后第4天為表達(dá)高峰，第10天檢測(cè)不到重組酶活性；通過(guò)肌肉注射途徑將改良型CTAB沉淀法純化的含CpG寡核苷酸序列的重組質(zhì)粒pcDNKCpG注射入雞和豬體內(nèi)，對(duì)不同時(shí)間段提取的動(dòng)物組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和核酸雜交試驗(yàn)，結(jié)果提示重組質(zhì)粒主要分布在雞和豬的血液和注射部位肌肉中，殘留時(shí)間分別不超過(guò)16天和8天，重組質(zhì)粒不能在試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中轉(zhuǎn)