銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因的克隆及在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、彈性蛋白酶(elastase)是一種以分解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜肽鏈內(nèi)切酶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物及人的各種組織和體液中。彈性蛋白酶不僅能水解彈性蛋白，而且也可以水解其他蛋自質(zhì)，如明膠、血紅蛋白、自蛋白、血纖維蛋白等。因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、日用化工及環(huán)境治理等行業(yè)，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。目前國內(nèi)主要從豬胰臟中提取，由于酶源受到限制，作為治療用生化藥物和其它方面的應(yīng)用長(zhǎng)期供不應(yīng)求。 本研究以一產(chǎn)彈性蛋白酶的銅綠

2、假單胞菌基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1.5kb的彈性蛋白酶基因，測(cè)序后與GeneBank中的銅綠假單胞菌序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)同源性100﹪。然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆，獲得質(zhì)粒pMD18-Ela。將彈性蛋白酶基因切下，轉(zhuǎn)入到載體pET28-a的6×His標(biāo)簽序列下游的多克隆位點(diǎn)獲得中間載體pET28a-Ela。連同6×His序列一起將彈性蛋白酶基因克隆到桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的pBacPAK8轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建了重組載體pBacPAK8-

3、His-Ela。同時(shí)，將綠色熒光蛋白基因直接克隆到pBacPAK8構(gòu)建一對(duì)照載體pBacPAK8-GFP。用BamHⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)pBacPAK8-His-Ela進(jìn)行雙酶切和單酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶及上游6×His序列正確插入到桿狀病毒多角體啟動(dòng)子下。 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將兩個(gè)轉(zhuǎn)移載體和親本病毒一起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系sf21，72小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察到對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，供試樣品組的細(xì)胞也發(fā)生了明顯的

4、NPV感染癥狀和病變?；厥占?xì)胞培養(yǎng)上清，空斑純化獲得了重組病毒BacPAK-Ela及BacPAK-GFP。以擴(kuò)大培養(yǎng)后的重組病毒BacPAK-Ela感染sf21細(xì)胞，96小時(shí)后分離培養(yǎng)基和細(xì)胞層進(jìn)行以下試驗(yàn)：提取感毒細(xì)胞DNA作為模板，對(duì)彈性蛋白酶基因cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠得到1.5kb條帶；提取感毒細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)與彈性蛋白酶(33KDa)大小相近的34KDa條帶。以彈性蛋白為底物的平板水解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)

5、感毒細(xì)胞裂解液能夠水解其專一底物彈性蛋白，證實(shí)了外源基因產(chǎn)物具有一定的生物活性。以地衣紅-彈性蛋白為底物，通過和攻毒后不同時(shí)間的細(xì)胞裂解液進(jìn)行水解反應(yīng)測(cè)定酶活，得到了表達(dá)產(chǎn)物的最大酶活力為21u/ml。 通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，外源彈性蛋白酶的最適作用pH值為9.5，在7.0-8.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適作用溫度為37℃，溫度高于37℃時(shí)，酶活急劇下降，當(dāng)溫度達(dá)到50℃以上，酶幾乎完全失活。彈性蛋白酶耐熱性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在3