p38MAPK在GERD發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:近年來，隨著社會(huì)生活節(jié)奏的加快和人們作息、飲食習(xí)慣的改變，我國胃食管反流病（GERD）發(fā)病率日益增高。GERD嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，耗費(fèi)大量衛(wèi)生資源，對其發(fā)病機(jī)制的探索一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。GERD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與防御因素和侵襲因素的不平衡有關(guān)。根據(jù)內(nèi)鏡結(jié)果可分為反流性食管炎（簡稱RE）和非糜爛性反流病(簡稱NERD)兩種類型。
　　目前GERD的治療仍以質(zhì)子泵抑制劑為主，但即使是足劑量足療程，仍有40％

2、的患者治療失敗，而且有效的病例多需要長期服藥。有效治療方法的缺失推動(dòng)著研究者對其發(fā)病機(jī)制的深入探索及新治療手段的開發(fā)。
　　絲裂原活化蛋白激酶（簡稱MAPKs）作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)的參與了細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)育和內(nèi)臟高敏感等多方面的作用。p38 MAPK通路作為MAPK通路之一，Toll樣受體、TNF-α、IL-1、熱休克、脂多糖及缺氧等細(xì)胞刺激等因素可活化p38 MAPK，而p38

3、MAPK活化可上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本課題的研究目的是探討p38 MAPK通路在GRED發(fā)病過程中作用和地位。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分:原代培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞，給予酸刺激(pH5.0)15分鐘，觀察p38 MAPK通路的變化;人食管上皮細(xì)胞給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療，然后給予酸刺激（48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行7次，每次持續(xù)15分鐘），從炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)性一氧化

4、氮合酶/一氧化氮通路、上皮緊密連接功能蛋白三個(gè)角度探討p38 MAPK在酸刺激誘導(dǎo)的食管上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。
　　第二部分:原代培養(yǎng)人食管上皮細(xì)胞，給予胰蛋白酶刺激，觀察p38MAPK通路的變化;人食管上皮細(xì)胞給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療，然后給予胰蛋白酶刺激（48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行3次，每次持續(xù)4小時(shí)），從炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶/一氧化氮通路、上皮緊密連接功能蛋白三個(gè)角度探討p38 MAPK在胰蛋

5、白酶刺激誘導(dǎo)的食管上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。
　　第三部分:胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎(RE)模型，2周后，觀察大鼠食管上皮中p38 MAPK通路的變化;給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行治療，2周后，檢測胃內(nèi)容物的酸堿度;大體觀察和伊紅蘇木素染色觀察食管的病變程度;考察食管上皮的屏障功能，檢測食管組織中緊密連接功能蛋白的表達(dá);檢測食管組織中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá);CD68免疫染色考察食管上皮組織中炎性細(xì)胞的

6、侵潤程度，考察組織和血清中炎癥因子的表達(dá)水平;考察食管組織中iNOS蛋白表達(dá)水平和NO產(chǎn)物含量。通過這些檢測最終考察p38MAPK在胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎中的作用和地位。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　第一部分:
　　1)酸刺激15min后，食道上皮細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化程度隨著酸pH值的下降而增加。結(jié)果提示酸刺激可以激動(dòng)食道上皮細(xì)胞的p38 MAPK信號通路。
　　2)酸刺激后，食道上皮細(xì)胞中I

7、L-8，COX2，TNFα的mRNA水平明顯增加;給予p38MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中IL-8，COX2，TNFα的mRNA水平。
　　3)酸刺激后，食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)增加，NO水平增加;給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NO水平。
　　4)酸刺激后，食道上皮細(xì)胞中claudin-1、

8、occludin、ZO-1的mRNA水平明顯降低。給予p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理治療，claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA水平明顯增加。
　　第二部分:
　　1)胰蛋白酶刺激4小時(shí)后，食道上皮細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化程度隨著胰蛋白酶劑量的增加而增加。結(jié)果提示胰蛋白酶刺激激動(dòng)了食道上皮細(xì)胞的p38 MAPK信號通路。
　　2)胰蛋白酶刺激后，食道上皮細(xì)胞中IL-8，COX2，T

9、NFα的mRNA水平明顯增加;給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中IL-8，COX2，TNFα的mRNA水平。胰蛋白酶刺激后，食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)增加，NO水平增加;給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低食道上皮細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NO水平。
　　3)胰蛋白酶刺激后，食道上皮細(xì)胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平

10、明顯增加，而occludin的mRNA水平?jīng)]有明顯變化;給予p38 MAPK抑制劑SB203580進(jìn)行預(yù)處理治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以明顯增加食道上皮細(xì)胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平。
　　第三部分:
　　1)胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎(RE)模型，2周后，免疫組化和Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，RE大鼠食管上皮組織中p38MAPK磷酸化水平明顯增加，給予其抑制劑SB203580治療，可以降

11、低RE大鼠食管上皮組織中p38MAPK磷酸化水平。
　　2)胃底結(jié)扎加幽門限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎（RE）模型，2周后，RE大鼠胃內(nèi)容物的pH明顯降低，而p38MAPK抑制劑SB203580治療對之沒有明顯影響。術(shù)后2周后，RE實(shí)驗(yàn)組大鼠食管組織出現(xiàn)明顯的出血和腐蝕病變，HE染色可見鱗狀上皮基底細(xì)胞層增厚，乳頭向上皮腔面延長，炎性細(xì)胞浸潤，鱗狀上皮氣球樣變;給予p38MAPK抑制劑SB203580治療可以明顯減輕食管組織的病變。

12、
　　3)RE模型2周后，RE大鼠食管上皮組織中claudin-1蛋白表達(dá)明顯降低;上皮跨膜電阻抗(TER)明顯降低，提示RE大鼠食管上皮的屏障功能明顯下降。另外，RT-PCR結(jié)果顯示RE大鼠食管組織中occludin和ZO-1的mRNA水平明顯降低。給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后，RE大鼠食管上皮中claudin-1蛋白表達(dá)增加，跨膜電阻抗增加，occludin和ZO-1的mRNA水平明顯。
　　4)RE模

13、型2周后，免疫組化結(jié)果顯示RE大鼠食管上皮組織中基質(zhì)金屬蛋白酶3和9(MMP)的蛋白表達(dá)水平明顯增加;給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后，RE大鼠食管上皮中MMP3和MMP9蛋白表達(dá)明顯降低。
　　5)RE模型2周后，免疫組化結(jié)果顯示RE大鼠食管上皮組織中CD68表達(dá)明顯增加，提示上皮組織中炎性細(xì)胞侵潤增加;RT-PCR結(jié)果顯示RE大鼠食管組織中TNFα、IL-6、 IL-1β的mRNA水平明顯增加，而ELISA結(jié)果顯

14、示RE大鼠血清中TNFα、IL-6、 IL-1β的蛋白水平明顯增加。給予p38MAPK抑制劑SB203580治療后，RE大鼠食管上皮中炎性細(xì)胞侵潤減少（CD68表達(dá)降低），組織中TNFα、IL-6、IL-1β的mRNA水平明顯降低，血清中TNFα、IL-6、 IL-1β的蛋白水平明顯降低。
　　6)RE模型2周后，RE大鼠食管組織中誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達(dá)水平明顯增加，組織中一氧化氮（NO）產(chǎn)物水平明顯增加，3-硝基