PGAM1調(diào)控糖酵解流誘導卵巢癌細胞耐紫杉醇的機制研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一，而致死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，嚴重危害女性健康。二十一世紀初以來，由于紫杉醇等新型化療藥物的問世及廣泛引進中國，使得卵巢癌的近期完全緩解率明顯提高，但是總體死亡率并沒有減少。化療耐藥是晚期卵巢癌患者治療失敗和死亡的最主要原因之一。破解紫杉醇耐藥是提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵。
　　紫杉醇作為抗微管藥物，是應用最為廣泛的一線化療藥物，其抗腫瘤的機制是通過促進微管蛋白聚合并且抑制蛋白聚

2、合體的解聚，使微管在細胞有絲分裂期失去應有的活性，起到抑制腫瘤細胞有絲分裂的作用。證據(jù)表明，腫瘤細胞暴露紫杉醇后能夠通過一系列的適應性改變逃避紫杉醇的殺傷，但相關(guān)的機制研究主要集中于微管相關(guān)分子突變或表達異常，微管穩(wěn)定性改變等使得紫杉醇與微管結(jié)合障礙，跨膜外流轉(zhuǎn)運蛋白的過表達所致的紫杉醇泵出增加以及凋亡相關(guān)分子的功能減弱等，但迄今未見針對這些機制而設計的策略應用于臨床。腫瘤細胞表現(xiàn)出糖酵解增強的特性，而近期研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇的耐藥機制也可

3、能與糖酵解流增強相關(guān)。
　　增強的糖酵解流進一步導致腫瘤細胞耐藥可能有三方面的機制:第一，糖酵解流增強能使腫瘤細胞快速獲得能量取得生存優(yōu)勢;第二，線粒體呼吸功能受到抑制，氧化磷酸化途徑受到削弱，氧自由基產(chǎn)生減少，細胞逃避凋亡和自噬，導致細胞程序性死亡減少;第三，糖酵解流增強的同時，其旁路磷酸戊糖途徑增強，產(chǎn)生的NADPH和磷酸核糖滿足了生物大分子特別是核酸合成的需要，用以修復損傷的DNA以及細胞的快速增殖。
　　本研究首先在

4、前期蛋白組學的基礎(chǔ)上，通過Western blot驗證PGAM1在卵巢癌耐紫杉醇細胞的高表達，并觀察紫杉醇對卵巢癌細胞PGAM1表達的誘導作用;采用siRNA干擾下調(diào)和pCMV4-PGAM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)PGAM1表達、及改變糖酵解的終產(chǎn)物-丙酮酸產(chǎn)量觀察對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的影響;最后利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學、信息學分析及基因功能試驗，確定DDIT4蛋白可能參與PGAM1對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控。旨在從糖代謝途徑闡述卵巢癌耐

5、藥機制，為探索卵巢癌靶向治療的新途徑提供科學證據(jù)。
　　第一部分PGAM1表達及糖酵解流對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用目的:
　　通過觀察紫杉醇誘導對卵巢癌細胞PGAM1表達及糖酵解流的影響、及反向調(diào)控PGAM1表達和糖酵解流對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的影響，確定PGAM1及糖酵解流對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用。
　　方法:
　　本部分研究首先通過western blot證實PGAM1在耐紫杉醇卵巢癌細胞

6、亞系SKOV3-TR30和親本細胞SKOV3中的表達差異，通過紫杉醇刺激，觀察卵巢癌細胞PGAM1表達的變化。然后采用siRNA干擾下調(diào)PGAM1表達及用pcMV4-PGAM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)PGAM1表達，觀察卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的變化。最后，在耐紫杉醇細胞株和親本細胞株中，測定單位細胞糖酵解終產(chǎn)物-丙酮酸的產(chǎn)量并比較兩者差異，并且在培養(yǎng)基中逐漸增加丙酮酸的濃度，觀察細胞紫杉醇敏感性的改變。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢癌耐紫杉

7、醇細胞株SKOV3-TR30的PGAM1表達較親本細胞高，紫杉醇刺激能誘導卵巢癌細胞SKOV3的PGAM1表達升高。
　　2.下調(diào)PGAM1表達使得卵巢癌細胞的紫杉醇敏感性增強;上調(diào)PGAM1表達使得卵巢癌細胞的紫杉醇敏感性下降。
　　3.耐紫杉醇細胞株單位細胞糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)量也比親本細胞顯著升高，培養(yǎng)基中添加一定濃度的丙酮酸或者乳酸能導致SKOV3的紫杉醇敏感性下降。
　　結(jié)論:
　　1.PGAM1參與

8、卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性的調(diào)控。
　　2.改變糖酵解終末產(chǎn)物濃度可影響PGAM1對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控。
　　第二部分參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇敏感性信號分子的篩選與驗證
　　目的:
　　通過RNA測序及生物信息學分析等，篩選并驗證參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇敏感性中的下游信號分子。
　　方法:
　　首先，我們在卵巢癌耐紫杉醇細胞株中通過siR-PGAM1轉(zhuǎn)染對目的分子PGAM1

9、進行下調(diào)，western blot測定干擾效率滿意，將樣本準備后送RNA-seq檢測(siRNA-PGAM1及陰性對照組，每組設3次生物學重復)。提取出的細胞總RNA建立cDNA文庫后用Illumina Hi-seq 2000測序平臺進行測序。測序結(jié)果經(jīng)過比對分析后篩選出差異表達基因。然后對這些差異表達基因進行KEGG和GO聚類分析。最后在差異表達基因中利用GeneMANIA網(wǎng)絡在線軟件進行生物信息學分析，篩選出候選蛋白作為PGAM1調(diào)

10、控卵巢癌細胞的紫杉醇敏感性的關(guān)鍵分子。
　　結(jié)果:
　　1.RNA測序共得到除PGAM1外100個差異表達基因，其中包括43個上調(diào)基因，57個下調(diào)基因。
　　2.GO及KEGG聚類分析發(fā)現(xiàn)，代謝過程是主要的信號的通路。
　　3.生物信息學分析這100個差異表達基因所對應的蛋白的互作結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，與PGAM1發(fā)生共表達的蛋白共有四個，分別為DDIT4、ADM、 AP3S1和和FTL，根據(jù)這四個蛋白的功能，DDIT4

11、作為下游信號分子參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的可能性最大。
　　4.在SKOV3-TR30細胞中，用siR-PGAM1下調(diào)PGAM1的表達后，在mRNA和蛋白水平驗證DDIT4的表達水平同時被下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.存在多個信號通路參與PGAM1對卵巢癌細胞SKOV3紫杉醇敏感性的調(diào)控過程，其中代謝過程是主要的信號的通路。
　　2.DDIT4可能是參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的下游信號

12、分子。
　　第三部分 DDIT4參與PGAM1對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控
　　目的:
　　利用基因功能試驗和計算機模擬分子對接模型，確定DDIT4參與PGAM1調(diào)控卵巢癌細胞紫杉醇敏感性，及P GAM1與DDIT4相互作用的結(jié)構(gòu)學機制。
　　方法:
　　采用siRNA干擾下調(diào)DDIT4表達及用pcDNA3.1-DDIT4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)DDIT4的表達，觀察卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的改變。并且，調(diào)節(jié)PGAM1

13、表達后，再反向調(diào)控DDIT4的表達，觀察PGAM1對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用能否被逆轉(zhuǎn)。
　　DDIT4是一個新近發(fā)現(xiàn)的蛋白，其三級結(jié)構(gòu)還沒有被解析。我們利用計算機同源建模的方法模擬DDIT4的蛋白三級結(jié)構(gòu)，并對DDIT4和已知三級結(jié)構(gòu)的PGAM1蛋白的對接進行計算機模擬，預測DDIT與PGAM1蛋白相互作用的結(jié)合位點及蛋白-蛋白復合物穩(wěn)定性。
　　結(jié)果:
　　1.下調(diào)DDIT4表達可增強卵巢癌細胞對紫杉醇敏感

14、性，上調(diào)DDIT4表達可減弱卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性。
　　2.DDIT4能逆轉(zhuǎn)PGAM1對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用。
　　3.DDIT4以類似于遙爪的形式結(jié)合在PGAM1受體蛋白外，并與其氨基酸殘基發(fā)生強烈的氫鍵相互作用，兩者可能通過三個主要結(jié)合位點進行穩(wěn)定結(jié)合，形成蛋白-蛋白復合物。
　　結(jié)論:
　　1.PGAM1通過與DDIT4相互結(jié)合對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性進行調(diào)控。
　　2.PGAM1與D