番茄高頻轉(zhuǎn)化體系的建立及RNAi載體構(gòu)建的研究.pdf

1、番茄作為一種重要的蔬果作物，是世界上重要的食用經(jīng)濟作物之一。番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)是雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬，通過煙粉虱來傳播，其引起的病毒會導(dǎo)致番茄大規(guī)模的減產(chǎn)，同樣給予菜農(nóng)經(jīng)濟上的損失?？刂品腰S化曲葉病毒病的有效方法是培養(yǎng)新的抗病毒品種。集高效性、可遺傳性、特異性和生物安全性于一身的RNAi技術(shù)成為了抗病育種的有效方法之一。
　　 本研究通過選取TYLC

2、V病毒基因組上的保守基因片段V1，驗證其轉(zhuǎn)基因番茄對病毒的抗性。將V1片段以正反兩向連接pFGC5941載體中內(nèi)含子兩端，構(gòu)建RNAi載體pFGC5941-V1B-V1A。
　　 將RNAi載體pFGC5941-V1B-V1A的RNAi轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，留作農(nóng)桿菌侵染實驗。用攜帶pFGC5941-V1B-V1A的RNAi載體的農(nóng)桿菌來侵染處于2-3葉期的番茄幼苗;20d后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法通過攜帶TYLCV全基因組的質(zhì)粒

3、來侵染番茄植株，通過觀察番茄植株發(fā)病癥狀態(tài)和對其病毒DNA的擴增，檢測片段V1的抗病效果。顯示結(jié)果為，片段V1可以引起siRNA的機制，遏制或削弱番茄植株中TYLCV基因的積累。
　　 在番茄愈傷組織培育過程中，子葉誘導(dǎo)愈傷和不定芽發(fā)生的效果最好，其最適培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L IAA+1.0 mg/L6-BA，最適生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IAA;通過實驗數(shù)據(jù)比較，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄的最適侵染時間為20 min