小鯢科線粒體基因的序列分析及其分子系統(tǒng)學(xué)研究.pdf

1、有尾兩棲類是現(xiàn)存最低等的陸生脊椎動(dòng)物,是地球上由水生轉(zhuǎn)向陸生較原始的現(xiàn)存動(dòng)物.它對研究生物的進(jìn)化有著重要科研價(jià)值.小鯢科是有尾目中最原始的一個(gè)類群,在有尾類研究中處于重要地位.該文根據(jù)兩棲類動(dòng)物線粒體兩端的特征序列確定編碼區(qū)所在位置,設(shè)計(jì)特異性引物采用PCR技術(shù)從小鯢科基因組DNA中擴(kuò)增出線粒體基因細(xì)胞色素b和16S rRNA部分編碼序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.0%的瓊脂糖凝膠EB電泳、純化、回收后轉(zhuǎn)化,再應(yīng)用抗生素篩選法隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行

2、PCR檢測.鑒定陽性克隆后對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序.測序結(jié)果采用DNASTAR軟件包(DNASTAR Inc,1996)中的MegAlign程序?qū)ν葱蛄羞M(jìn)行排列,并經(jīng)人工仔細(xì)核查.在此基礎(chǔ)上,序列輸入MEGA2.1軟件包中計(jì)算不同序列間的變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)、顛換百分比、轉(zhuǎn)換/顛換比率和兩兩序列的遺傳距離;用MEGA2.1軟件基于Kimura 2-parameter距離采用鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,同時(shí)也

3、用PHYLIP3.6軟件包(Felsenstein,2001)使用Heuristic功能搜尋最大簡約法(Maximum Parsimony)和最大擬然法(Maximum Likehood)的系統(tǒng)重建.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示線粒體基因細(xì)胞色素b和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中顯示出清晰的特異性擴(kuò)增條帶,經(jīng)連接及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),在LB固體培養(yǎng)基上長出較多陽性克隆.隨機(jī)挑菌進(jìn)行PCR檢測,其結(jié)果皆為陽性克隆.說明成功克隆出新疆北鯢和

4、秦巴北鯢的線粒體基因細(xì)胞色素b和16S rRNA部分編碼序列,并將其重組入原核表達(dá)載體.對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序的結(jié)果經(jīng)DNASTAR、MEGA2.1、PHYLIP3.6軟件包的不同方法(Neighbor-Joining、Maximum Parsimony、Maximum Likehood)構(gòu)建出的分子系統(tǒng)樹基本相同.結(jié)果表明山溪鯢、無斑山溪鯢、北方山溪鯢是三個(gè)有效種;巴鯢是有效屬且與秦巴北鯢的親緣關(guān)系比較近;黃斑擬小鯢不是秦巴北鯢的同物異名