富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛能量平衡的影響及機(jī)理研究.pdf

1、反芻動(dòng)物因瘤胃代謝特點(diǎn)幾乎不能從瘤胃中直接攝取葡萄糖，機(jī)體所需的葡萄糖有90％是通過(guò)糖異生獲得。圍產(chǎn)期的奶牛，尤其是高產(chǎn)奶牛，因胎兒生長(zhǎng)和泌乳對(duì)能量的需求增加，干物質(zhì)攝入量(DMI)反而降低，致使能量攝入不能滿足能量需求而出現(xiàn)能量負(fù)平衡。為了彌補(bǔ)能量赤字，機(jī)體動(dòng)員體脂，過(guò)度的脂肪動(dòng)員就會(huì)導(dǎo)致能量代謝病的發(fā)生。而甘油與糖代謝關(guān)系十分密切，是動(dòng)物肝內(nèi)糖異生的重要前體，可有效解決反芻動(dòng)物因糖供應(yīng)不足而發(fā)生的能量代謝問(wèn)題。近年來(lái)，甘油作為生物燃

2、料副產(chǎn)品被過(guò)剩生產(chǎn)，使其在飼料添加劑領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，然而工業(yè)甘油含有大量有害雜質(zhì)（比如重金屬及甲醇），對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能和機(jī)體健康易產(chǎn)生不良影響，甚至通過(guò)畜產(chǎn)品影響到人類健康。發(fā)酵甘油則是利用某些微生物在特定條件下以糖類、淀粉或農(nóng)副產(chǎn)品為原料進(jìn)行生命活動(dòng)而產(chǎn)生的甘油。最終的發(fā)酵混合物不合有害雜質(zhì)，還省卻了甘油的提取和純化;而且富含甘油和對(duì)動(dòng)物機(jī)體有益的微生物，是一種無(wú)污染、無(wú)殘留的綠色飼料添加劑，在養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　

3、　本試驗(yàn)以從自然界中分離的高產(chǎn)甘油的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，NAU-ZH-GY1)為菌種，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化和連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵制備出富含甘油和酵母菌的能緩減反芻動(dòng)物能量負(fù)平衡的微生物飼料添加劑，并以圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛為動(dòng)試驗(yàn)對(duì)象系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能、血液生化指標(biāo)、酮病發(fā)生率的影響，通過(guò)對(duì)肝臟中糖異生關(guān)鍵酶和甘油激酶活性、mRNA和蛋白表達(dá)、以及瘤胃發(fā)酵性能及瘤胃微生物菌群變化等的

4、研究揭示了富甘油酵母菌制劑的作用機(jī)理。為富甘油酵母菌制劑在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
　　試驗(yàn)1.富甘油酵母菌制劑的發(fā)酵工藝優(yōu)化及制備
　　在已有最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分的條件下，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件，并通過(guò)連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵法進(jìn)一步最大化甘油產(chǎn)量和酵母菌干重;當(dāng)發(fā)酵液制成成品后，每15 d檢測(cè)一次產(chǎn)品中甘油水平和釀酒酵母菌的活菌數(shù)，以評(píng)價(jià)富甘油酵母菌制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:獲得最大甘油產(chǎn)量的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為

5、30℃、恒定pH為5和溶氧(DO)為80％此條件下甘油濃度為38.7 g/L，細(xì)胞干重為13.1 g/L，活菌數(shù)為9.4 lg CFU/ml;在發(fā)酵第24 h和48 h各補(bǔ)料一次，發(fā)酵72 h結(jié)束，可獲得甘油濃度為75.8 g/L和細(xì)胞干重為15.8 g/L的富甘油酵母菌制劑;在常溫下存放3個(gè)月之內(nèi)，產(chǎn)品中甘油和活菌數(shù)均能保持較高的水平，在存放第90 d，其甘油濃度為74.5 g/L，酵母菌活菌數(shù)不低于8 lg CFU/mL，表明該甘油

6、制劑在常溫下可以保存3個(gè)月不變質(zhì)，穩(wěn)定性較好。
　　試驗(yàn)2.日糧中添加富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能的影響
　　本試驗(yàn)通過(guò)給圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加富甘油酵母菌制劑來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能的影響。43頭經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分成4個(gè)試驗(yàn)組:對(duì)照組(control，C)、甘油組(glycerol，G)、酵母菌組(yeast，Y)和富甘油酵母菌制劑組（glycerol-enrichedyeast product

7、s，GYP），對(duì)照組奶牛飼喂基礎(chǔ)日糧，甘油組奶牛在基礎(chǔ)日糧上每天每頭添加150 g食品級(jí)甘油（0.998 g/g），酵母菌組奶牛在基礎(chǔ)日糧上每天每頭添加1L酵母培養(yǎng)物（含酵母干重31.1 g），富甘油酵母菌組奶牛在基礎(chǔ)日糧上每天每頭添加2L富甘油酵母菌制劑（含甘油151.6 g，酵母干重30.6g)。所有的添加劑都于晨飼時(shí)拌于飼喂總量的前1/3中，試驗(yàn)從產(chǎn)前14 d開(kāi)始至產(chǎn)后28 d結(jié)束。于試驗(yàn)每日測(cè)定DMI、產(chǎn)后每日測(cè)定奶產(chǎn)量、每周進(jìn)

8、行一次乳成分測(cè)定，產(chǎn)犢時(shí)評(píng)價(jià)分娩系數(shù)(CC)以及于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束測(cè)定所有受試奶牛的體重(BW)和體況評(píng)分(BCS)。試驗(yàn)結(jié)果顯示:所有試驗(yàn)組奶牛的DMI、BW和BCS變化以及CC差異不顯著（P＞0.05）。日糧中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛的泌乳量和4％乳脂校正乳(FCM)無(wú)顯著影響(P＞0.05);與對(duì)照組和甘油組相比，酵母菌組和富甘油酵母菌制劑組奶牛的乳脂率、乳蛋白率以及乳蛋白日產(chǎn)量顯著提高(P＜0.05);富甘油

9、酵母菌制劑組奶牛的乳中體細(xì)胞數(shù)(SCC)也顯著降低(P＜0.05)，而酵母菌制劑組奶牛的乳中SCC具有一定的降低趨勢(shì)（P＜0.15），說(shuō)明日糧中添加富甘油酵母菌制劑能顯著改善奶牛的乳品質(zhì)，對(duì)乳房炎具有一定的防治作用。
　　試驗(yàn)3.日糧中添加富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛血液代謝指標(biāo)的影響
　　本試驗(yàn)通過(guò)給圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加富甘油酵母菌制劑，檢測(cè)奶牛的血液生化指標(biāo)以及酮病的發(fā)生率來(lái)評(píng)價(jià)該制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛能量狀態(tài)以及酮病發(fā)病率的

10、影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)2，試驗(yàn)從產(chǎn)前14d開(kāi)始至產(chǎn)后28 d結(jié)束。于分娩第-14、-7、-1、7、14、21和28 d晨飼后3h，采集尾靜脈血液測(cè)定血液中的生化指標(biāo)，以血液中β-羥丁酸(BHBA)濃度為1.0 mmol/L扣2.6 mmo/L作為亞臨床型酮病和臨床型酮病的判定標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示:日糧中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制劑對(duì)血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBiL)、直接膽紅素(DBiL)、肌酐(Crea)

11、和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的濃度無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但添加酵母菌和富甘油酵母菌制劑能顯著升高血漿鈣(Ca)和總蛋白(TP)濃度（P＜0.05），對(duì)血漿磷(P)濃度具有一定的升高趨勢(shì)（P=0.10），而對(duì)血漿尿素(Urea)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度具有一定的降低趨勢(shì)（P=0.07，P=0.10）。與對(duì)照組和酵母菌組相比，甘油組和富甘油酵母菌制劑組奶牛的血糖水平顯著升高(P＜0.05)，血漿BHBA和非酯化脂肪酸（NEFA）水平

12、顯著降低(P＜0.05);其臨床型酮病和亞臨床型酮病的發(fā)病率也明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明富甘油酵母菌制劑能充分發(fā)揮甘油作為生糖前體的作用，能顯著改善圍產(chǎn)期奶牛的能量平衡狀態(tài)和降低酮病發(fā)生率。
　　試驗(yàn)4.日糧中添加富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛肝臟內(nèi)糖異生關(guān)鍵酶及甘油激酶的影響
　　本試驗(yàn)通過(guò)給圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加富甘油酵母菌制劑，檢測(cè)奶牛產(chǎn)后第14d肝臟內(nèi)丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及甘油激酶(GK

13、)的酶活性、mRNA和蛋白表達(dá)來(lái)揭示該制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛葡萄糖異生作用的調(diào)節(jié)機(jī)理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)2，試驗(yàn)從產(chǎn)前14 d開(kāi)始至產(chǎn)后28 d結(jié)束。于分娩后第14 d從各試驗(yàn)組中隨機(jī)選取5頭奶牛，肝臟活體穿刺采集其肝臟組織，應(yīng)用分光光度法、Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)組織中PC、PEPCK和GK的酶活性、mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，富甘油酵母菌制劑組奶牛產(chǎn)后第14d肝臟內(nèi)PEPCK的活性以及胞

14、漿型PEPCK(PEPCK-C)的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05);GK的活性顯著升高（P＜0.05），其mRNA表達(dá)水平有升高趨勢(shì)(P=0.088);但PC的活性、mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果說(shuō)明日糧中添加富甘油酵母菌制劑通過(guò)上調(diào)PEPCK的酶活性以及PEPCK-C的mRNA和蛋白表達(dá)水平、以及上調(diào)GK的酶活性和mRNA表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)葡萄糖異生而升高奶牛血糖水平，從而改善奶牛的能量平衡狀態(tài)。<

15、br>　　試驗(yàn)5.日糧添加富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃的發(fā)酵性能及微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　本試驗(yàn)通過(guò)給圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加富甘油酵母菌制劑，檢測(cè)奶牛產(chǎn)前產(chǎn)后笫14 d瘤胃內(nèi)發(fā)酵參數(shù)變化和瘤胃微生物菌群變化來(lái)揭示該制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃發(fā)酵特性和內(nèi)環(huán)境的調(diào)控機(jī)理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)2，試驗(yàn)從產(chǎn)前14 d開(kāi)始至產(chǎn)后28 d結(jié)束。于分娩前后第14d采集所有受試奶牛的瘤胃液，測(cè)定瘤胃液中的發(fā)酵參數(shù)和提取瘤胃液的總DNA，利用細(xì)菌通用引物2

16、7F/342R擴(kuò)增16S rDNA的基因序列，用HhaⅠ酶對(duì)克隆片段進(jìn)行限制性酶切，產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析、聚類，對(duì)瘤胃中主要細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA基因序列克隆，運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示:日糧中添加甘油、酵母菌和富甘油酵母菌制劑對(duì)圍產(chǎn)期奶牛產(chǎn)后瘤胃內(nèi)pH、乙酸和丁酸摩爾百分比影響差異不顯著(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，甘油組、酵母菌組和富甘油酵母菌制劑組奶牛產(chǎn)后瘤胃內(nèi)揮

17、發(fā)性脂肪酸(VFA)和丙酸摩爾百分比顯著性升高（P＜0.05），而乙酸丙酸比例顯著性降低(P＜0.05)，氨氮濃度有降低的趨勢(shì)(P=0.08)，說(shuō)明日糧中添加富甘油酵母菌制劑能顯著改善國(guó)產(chǎn)期奶牛的瘤胃發(fā)酵性能，改善瘤胃發(fā)酵模式。相對(duì)于產(chǎn)前，在產(chǎn)后厚壁菌門細(xì)菌顯著升高(P＜0.05)，而變形菌門細(xì)菌顯著降低（P＜0.05）;其中甘油組、酵母菌組和富甘油酵母菌制劑組奶牛瘤胃內(nèi)厚壁菌門細(xì)菌在產(chǎn)后顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而變形菌門、擬桿

18、菌門和軟壁菌門在各試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，富甘油酵母菌制劑組奶牛產(chǎn)后瘤胃中乳酸生成菌牛鏈球菌以及乳酸降解菌反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），而甘油組和酵母菌組奶牛瘤胃內(nèi)反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌的數(shù)量也顯著升高(P＜0.05)，但牛鏈球菌數(shù)量升高不顯著(P＜0.15)，說(shuō)明日糧中添加富甘油酵母菌制劑能顯著改善圍產(chǎn)期奶牛瘤胃內(nèi)的微生物區(qū)系，能顯著提高利于丙酸生成的細(xì)菌數(shù)量而提高丙酸產(chǎn)