IHHNV衣殼蛋白-凡納濱對蝦鰓細(xì)胞膜受體的初步研究.pdf

1、對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒病（Infectious Hypodermal andHaematopoietic Necrosis，IHHN）為對蝦主要病毒病之一，近些年，IHHN流行范圍遍布全球各地，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。IHHHV敏感宿主是細(xì)角濱對蝦和凡納濱對蝦，對細(xì)角濱對蝦引起急性感染和高死亡率，對凡納濱對蝦可導(dǎo)致慢性矮小殘缺綜合癥(RDS)，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將IHHNV列為須向其申報的甲殼類重

2、要疾病之一。目前，IHHNV在流行病學(xué)和診斷方面受到重視，但其致病機理鮮有報道。本文重點著力于IHHNV衣殼蛋白鰓細(xì)胞膜受體的研究，通過VOPBA、Pull Down、噬菌體隨機十二肽庫，篩選IHHNV CP受體蛋白，為IHHNV進(jìn)一步研究提供依據(jù)。
　　本文首先提取IHHNV射陽株發(fā)病凡納濱對蝦鰓組織的DNA，根據(jù)GenBank公布的射陽株序列(Accession KF214742)設(shè)計引物構(gòu)建了IHHNV CP原核表達(dá)載體。進(jìn)

3、行蛋白原核表達(dá)，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，用HisTrapTM HP柱純化目的蛋白后，進(jìn)行尿素透析，將透析后的蛋白免疫新西蘭白兔，制備多克隆抗體，三免后抗體效價達(dá)到1∶102400。
　　利用勻漿、超速離心分離未感染IHHNV凡納濱對蝦的鰓細(xì)胞膜蛋白，獲得均勻分布的凡納濱對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白條帶。
　　利用VOPBA結(jié)合Pull Down實驗篩選IHHNV CP凡納濱對蝦鰓細(xì)胞膜受體，得到Signal transducer

4、and activator of transcription(STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)、Heatshock protein90(熱休克蛋白90)、Prophenoloxidase-2(酚氧化酶原2型)、Na+/K+-ATPasealpha subunit（Na+/K+-ATP酶a亞基）、NM23 protein五種蛋白。將NM23基因構(gòu)建到pGEX-4t-1原核表達(dá)載體上，進(jìn)行原核表達(dá)，用GST磁珠進(jìn)行純化，進(jìn)行NM23與CP的

5、VOPBA和NM23與CP的GST Pull Down驗證實驗，結(jié)果表明，NM23能與IHHNV CP相互作用。
　　利用噬菌體隨機十二肽庫淘選IHHNV CP結(jié)合肽，經(jīng)過三次親和→洗脫→擴增→親和的循環(huán)淘洗過程，得到6種十二肽可以與IHHNV CP結(jié)合，A(SWSSWVYRDPQT)、B(HSFKWLDSPRLR)、C(SSFKWLDSPRLR)、D(HRSKWVYSDPQR)、E(YWSKWVDWHPQR)、F(SSCKWVD