鹽地堿蓬SsNHX1基因的克隆及轉(zhuǎn)基因擬南芥的培育.pdf

1、鹽脅迫條件下,植物細胞滲透均衡和離子正常均衡狀態(tài)被破壞,特別是胞質(zhì)中過多的Na<'+>對植物細胞的代謝產(chǎn)生毒害,影響到植物細胞的調(diào)節(jié)機制.植物細胞為適應(yīng)脅迫環(huán)境,具有一系列的適應(yīng)機制,一方面積累可溶性物質(zhì);另一方面,尤其是鹽生植物則通過Na<'+>外排或者Na<'+>區(qū)隔化和調(diào)整K<'+>/H<'+>比率的機制來保持胞質(zhì)內(nèi)較低的Na<'+>濃度,以消除Na<'+>的毒害,此過程中,Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運蛋白起到重要作用.甜土植

2、物擬南芥胞內(nèi)控制離子區(qū)隔化基因AtNHX1及Na<'+>外排的基因SOS1均已克隆,并且AtNHXI在擬南芥中的過量表達顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性,開創(chuàng)了降低Na<'+>毒害的基因操作新途徑.真鹽生植物鹽地堿蓬基因SsNHX1對離子均衡所起的作用,通過SsNHX1基因在擬南芥中的過量表達,進行進一步的研究,對于植物細胞離子均衡研究具有重要意義.該實驗對鹽地堿蓬SsNHX1基因進行了克隆(GenBank注冊號AF370358).由于Na

3、<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運蛋白基因已在擬南芥,水稻等植物中得到克隆.不同的Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運蛋白基因具有保守區(qū)域,根據(jù)保守區(qū)段設(shè)計引物,擴增得到SsNHX1的部分片段,利用RACE方法得到其兩端序列.由序列設(shè)計兩端特異引物,RT-PCR擴增到SsNHX1全長cDNA,將其克隆并進行序列分析,結(jié)果與報導(dǎo)的其他物種中的Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運蛋白序列具有較高的同源性.SsNHX1基因cDNA全長1665bp,編碼一個

4、分子量約61kD的蛋白.得到SsNHX1片段后,對其在堿蓬中的拷貝數(shù)及表達特性進行了分析,Southern結(jié)果表明SsNHX1在堿蓬中至少有3個拷貝,應(yīng)是一個基因家族.Nothern結(jié)果顯示SsNHX1是受鹽脅迫誘導(dǎo)的基因,特別是在葉中的表達更易受到鹽誘導(dǎo),這與其Na<'+>/H<'+>轉(zhuǎn)運的功能相一致.將SsNHX1cDNA全長ORF克隆入表達載體pROK2中,導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌GV3101后,由滲透法進行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)分子