水稻細(xì)菌性條斑病菌中hshB基因及其所在基因簇功能的研究.pdf

1、水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）屬于原核生物界，黃單胞菌科黃單胞菌屬的一種稻黃單胞菌（X.oryzae），在水稻上引起細(xì)菌性條斑病，該病主要危害水稻的葉片，嚴(yán)重威脅熱帶及亞熱帶地區(qū)水稻的種植。稻黃單胞菌包括兩個(gè)致病變種，分別是稻致病變種（X.oryzae pv.oryzae，Xoo）和稻生致病變種(X.oryzae pv.oryzicola，Xoc)。雖然Xoo與Xoc均屬于稻

2、黃單胞菌，但兩種菌感染水稻葉片的機(jī)制卻不同。相比我們對(duì)于Xoo的了解，對(duì)于Xoc的致病分子機(jī)制所知的卻較少。群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)，是細(xì)菌通過(guò)分泌信號(hào)分子來(lái)監(jiān)測(cè)群體的密度，使細(xì)菌群體能夠依靠群體密度或者生長(zhǎng)階段來(lái)調(diào)控菌體的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌生物學(xué)功能的一種細(xì)胞間信號(hào)交流機(jī)制。黃單胞屬細(xì)菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要依賴于可擴(kuò)散性信號(hào)分子(DSF)，且該系統(tǒng)在黃單胞屬細(xì)菌中高度保守。在前期的研究工作中，證實(shí)水稻細(xì)菌性條

3、斑病菌具有DSF依賴性群體感應(yīng)系統(tǒng)，且DSF信號(hào)分子由rpfF基因負(fù)責(zé)合成，缺失rpfF基因后菌體徹底喪失合成DSF信號(hào)分子的能力，以及在水稻上的致病性。
　　為了更好地解析水稻細(xì)菌性條斑病菌中DSF依賴性群體感應(yīng)系統(tǒng)是如何調(diào)控菌體致病能力的，在前期的工作中，利用蛋白雙向電泳技術(shù)，比較分析了條斑病菌野生型菌株Rs105與基因rpfF缺失突變體的胞內(nèi)蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，并最終鑒定到18個(gè)蛋白，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)這18個(gè)蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)

4、，發(fā)現(xiàn)它們涉及鞭毛形成、活性氧抗性及氮源轉(zhuǎn)換等生物學(xué)功能，其中鑒定發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由hshB基因編碼的蛋白為菌體致病所必須。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，基因hshB（相較水稻白葉枯菌PX099A而言）為水稻細(xì)菌性條斑病菌特有，與此同時(shí)，基因hshB不僅受細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)DSF及全局性調(diào)控因子clp調(diào)控，缺失該基因后，還會(huì)嚴(yán)重的削弱菌體的致病性、胞外蛋白酶的分泌、胞外多糖的產(chǎn)生以及對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性，并且該基因的轉(zhuǎn)錄受到營(yíng)養(yǎng)貧瘠條件誘導(dǎo)，但對(duì)于基因h

5、shB具體的作用機(jī)制并不清楚。
　　本研究中，首先通過(guò)生物信息學(xué)分析了hshB基因編碼蛋白可能具有的結(jié)構(gòu)域及生物學(xué)功能，進(jìn)一步通過(guò)生物學(xué)性狀測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了基因hshB突變體的游動(dòng)能力相較野生型菌株顯著降低，同時(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，基因hshB缺失后影響條斑菌中305個(gè)基因顯著差異表達(dá)，且這些差異表達(dá)基因不僅涉及菌體致病性、蛋白酶分泌、碳源代謝、氮源代謝、抗氧化壓力、運(yùn)動(dòng)能力、趨化性及生物膜形成等多方面內(nèi)容，差異基因的富集分析還顯示，hs

6、hB調(diào)控的基因主要集中在菌體運(yùn)動(dòng)能力和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩方面，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)現(xiàn)不僅證明了生物學(xué)性狀測(cè)定的準(zhǔn)確性，同時(shí)也為下一步研究提供了方向。深入分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，hshB還調(diào)控參與菌體生物膜形成相關(guān)的基因，通過(guò)多種方法測(cè)定后，證實(shí)hshB突變后確會(huì)增強(qiáng)菌體的生物膜形成，同時(shí)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，綜合基因hshB突變?cè)鰪?qiáng)菌體的生物膜形成，降低菌體運(yùn)動(dòng)能力的作用，初步揭示出基因hshB與細(xì)胞環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)受體YajQ的關(guān)系，推測(cè)

7、出基因hshB可能是通過(guò)調(diào)節(jié)菌體內(nèi)的c-di-GMP濃度來(lái)發(fā)揮作用的。本研究不僅揭示出基因hshB在調(diào)控菌體運(yùn)動(dòng)能力方面的新功能，同時(shí)深入發(fā)掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，初步揭示了基因hshB調(diào)控菌體致病性、胞外蛋白酶及過(guò)氧化氫的耐受性等方面的機(jī)制，同時(shí)發(fā)掘并驗(yàn)證了基因hshB在調(diào)控菌體生物膜形成方面也具有重要作用，并且hshB作用機(jī)制與菌體內(nèi)的c-di-GMP密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步深入解析hshB基因的致病機(jī)制提供了研究方向。
　　在深入

8、研究分析hshB基因本身的同時(shí)，我們對(duì)于hshB基因所在的nodB-rghB基因簇也進(jìn)行了探究。在nodB-rghB基因簇中鑒定出兩個(gè)功能與hshB基因相似但又有諸多不同，為Xoc所特有（相較Xoo而言）同時(shí)受DSF信號(hào)調(diào)控的毒性相關(guān)基因hshA與hshC。該研究發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因的缺失突變?cè)诘兔芏冉臃N時(shí)致病力相較野生型有顯著下降，同時(shí)相較毒性基因hshB，這兩個(gè)基因?qū)w的體外生長(zhǎng)能力、胞外多糖的產(chǎn)生、過(guò)氧化氫的耐受能力以及蛋白酶的分泌

9、能力均沒(méi)有顯著影響，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，hshA與hshC缺失突變后導(dǎo)致菌體在水稻上的定殖能力以及附生定殖水平都顯著下降，初步揭示出hshA與hshC影響菌體致病性的機(jī)制。通過(guò)本研究中鑒定出的兩個(gè)新型受DSF信號(hào)調(diào)控的毒性相關(guān)基因（hshA與hshC），不僅增進(jìn)了我們對(duì)條斑病菌hshB基因所在的nodB-rghB基因簇的了解，同時(shí)也有助于對(duì)黃單胞菌中DSF信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控毒性基因機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　綜上，本文不僅揭示了hshB基因在調(diào)控菌