玉米抗蟲蛋白基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及活性研究.pdf

1、本文以玉米和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis為研究對(duì)象，利用玉米自身抗蟲蛋白質(zhì)完成對(duì)自然蟲害的有效治理具有重要的科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究茉莉酸甲酯誘導(dǎo)和昆蟲取食雙重脅迫條件下玉米防御蛋白的變化規(guī)律，通過與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析，分析用外源茉莉酸甲酯(MJA)誘導(dǎo)玉米，之后剪取葉片飼喂亞洲玉米螟后中腸內(nèi)含物總蛋白，篩選出潛在具有抗蟲活性的蛋白質(zhì)點(diǎn);在此基礎(chǔ)上，

2、合成特異性引物PCR擴(kuò)增了3個(gè)潛在植物抗蟲蛋白基因的克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建并誘導(dǎo)其融合蛋白表達(dá)，有2個(gè)進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行亞洲玉米螟生物活性測(cè)定，從而達(dá)到利用植物自身抗蟲大分子就能有效防御蟲害危害;在農(nóng)業(yè)上，為生物防治亞洲玉米螟提供一個(gè)新的思路，同時(shí)為研究植物抗蟲蛋白的作用機(jī)理積累了重要的理論材料。
　　 1、完成了經(jīng)MJA誘導(dǎo)玉米葉片飼喂亞洲玉米螟后中腸內(nèi)含物的表達(dá)差異蛋白質(zhì)組變化分析
　　 通過8plexiTRAQ技術(shù)和質(zhì)

3、譜分析以及Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，取食經(jīng)MJA誘導(dǎo)玉米葉片的亞洲玉米螟中腸內(nèi)含物iTRAQ技術(shù)共鑒定了32種蛋白，其中25種蛋白質(zhì)有顯著性的變化;15種蛋白質(zhì)為顯著上升;10種蛋白質(zhì)為顯著下調(diào)。
　　 2、成功構(gòu)建了植物抗蟲蛋白基因的原核表達(dá)載體及誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)
　　 對(duì)玉米螟取食經(jīng)茉莉酸甲酯(MJA)誘導(dǎo)玉米葉片消解后中腸內(nèi)容物iTRAQ進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，篩選出具有共同誘導(dǎo)特性和具有較大潛在活力的植物抗蟲防御蛋白

4、:NADP-malicenzyme(NME)，glutathione-S-transferase5(GST5)及glutathione-S-transferase19(GST19);結(jié)合玉米基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，根據(jù)primer5設(shè)計(jì)特異性引物完成目標(biāo)基因保守片段克隆和以pET系列載體作為表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建。目的基因與表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接反應(yīng)獲得重組表達(dá)載體，構(gòu)建好的重組載體分別命名為pET28a-ZmGST5、pET2

5、8a-ZmGST19及pET28a-ZmNME。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后pET28a-ZmGST5和pET28a-ZmGST19獲得了重組蛋白，蛋白分子量大小分別約為:pET28a-ZmGST5為25.24kD，pET28a-ZmGST19為25.12kD。
　　 3、明確了植物抗蟲蛋白基因?qū)喼抻衩酌紫x生長(zhǎng)抑制作用
　　 生物學(xué)活性測(cè)定顯示，pET28a-ZmGST5和pET28a-ZmGST19表達(dá)的重組蛋白對(duì)亞洲玉米螟幼