α-烯醇酶對(duì)胃癌細(xì)胞株AGS增殖、遷移能力的影響.pdf

1、[目的]：
　　檢測(cè)α-烯醇酶（α-enolase，ENO1）在胃癌組織的表達(dá)水平，研究ENO1表達(dá)與胃癌進(jìn)展的相關(guān)性;通過體外實(shí)驗(yàn)，研究ENO1對(duì)胃癌細(xì)胞株AGS增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為的影響，為揭示ENO1與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]：
　　1.采用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)ENO1在不同病理進(jìn)展的胃癌組織的表達(dá)情況:利用ENO1兔抗人多克隆抗體對(duì)22例胃腺癌標(biāo)本、18例正常胃黏膜組織標(biāo)本和20例

2、非典型增生組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，觀察ENO1在胃癌組織的表達(dá)水平。
　　2.克隆人eno1基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/eno1:根據(jù)人eno1基因序列(GenBank: NM001428.3)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增eno1基因編碼區(qū)序列，并采用T-A克隆法將目的基因連接于pMD18-T載體。限制性內(nèi)切酶EcoR1和Xba1分別雙酶切pMD18-T/eno1和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，體外連接構(gòu)建真核表達(dá)載體pc

3、DNA3.1/eno1并測(cè)序。
　　3.真核表達(dá)載體pcDNA3.1/eno1經(jīng)脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株AGS，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)eno1 mRNA和蛋白在AGS細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
　　4.通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，研究過表達(dá)eno1基因?qū)GS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　5.合成針對(duì)eno1基因的小干擾RN

4、A(siRNA)，轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，研究siRNA干擾eno1基因表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　[結(jié)果]：
　　1.ENO1在胃癌組織的表達(dá)
　　免疫組化的檢測(cè)結(jié)果顯示，ENO1的高表達(dá)率在胃腺癌中為27.2％(6/22)，而在正常胃黏膜組織和非典型增生組織中均為0％。ENO1在胃腺癌組織的表達(dá)水平與正常胃黏膜組織和非典型增生組織相比，差別具有統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)意義(HC=22.70，P＜0.05)。
　　2.真核表達(dá)載體pcDNA3.1/eno1的構(gòu)建
　　RT-PCR擴(kuò)增獲得eno1基因的編碼區(qū)序列(1305bp)，瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序證實(shí)與預(yù)期序列一致;利用基因工程技術(shù)，體外連接eno1基因與載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/eno1，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。
　　3.Eno1基因過表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

6、　　將真核表達(dá)載體pcDNA3.1/eno1和空載體peDNA3.1分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blot發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1/eno1組較空載體pcDNA3.1組相比，eno1基因mRNA和蛋白表達(dá)量高。同時(shí)，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染的72小時(shí)，pcDNA3.1/eno1組細(xì)胞增殖水平高于pcDNA3.1空載體組(t=3.44，P＜0.05);平板集落實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10天后，pcDNA3.1/e

7、no1組集落形成數(shù)量明顯高于pcDNA3.1組（t=5.26， P＜0.05）;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在48個(gè)小時(shí)后，pcDNA3.1/eno1組劃痕愈合速度快于空載體pcDNA3.1組（t=7.35， P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.siRNA干擾eno1基因表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響將針對(duì)eno1基因的小干擾RNA（ENO1-siRNA）和空白對(duì)照（NC-siRNA）分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量RT-P

8、CR和Western Blot發(fā)現(xiàn)干擾組ENO1-siRNA與空白對(duì)照組(NC-siRNA)相比，eno1基因mRNA和蛋白表達(dá)量較低。同時(shí)，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染的72小時(shí)，ENO1-siRNA組細(xì)胞增殖水平低于NC-siRNA空載體組(t=2.50，P＜0.05);平板集落實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10天后，ENO1-siRNA組集落形成數(shù)量明顯低于NC-siRNA組(t=22.05，P＜0.05);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在48個(gè)小時(shí)后，E

9、NO1-siRNA組劃痕愈合速度慢于空白對(duì)照組(NC-siRNA)(t=8.54，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)論]：
　　1.ENO1在胃癌組織的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織和非典型增生組織，提示ENO1表達(dá)與胃癌的進(jìn)展有關(guān);
　　2.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)eno1基因可使胃癌AGS細(xì)胞的增殖及遷移能力增強(qiáng);siRNA干擾eno1基因表達(dá)，可使AGS細(xì)胞的增殖及遷移能力減弱，提示ENO1可能是與胃癌細(xì)