甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆和功能研究.pdf

1、谷氨酰胺合成酶(GS；EC6.3.1.2)是植物N素同化途徑中最為關(guān)鍵的催化酶之一,被稱為是植物中無機(jī)態(tài)N轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)N的“門戶”,對(duì)植物N素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency)有著極為重要的影響。高等植物中的GS同工酶主要分為兩類:胞質(zhì)型GS1主要同化從土壤吸收的初級(jí)氨及再同化從植物體內(nèi)各個(gè)N循環(huán)途徑所釋放的氨；質(zhì)體型GS2同化由NO-3-N還原而來及光呼吸過程所釋放的氨。N素供應(yīng)對(duì)甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育、果

2、實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)形成有非常重要的影響,目前甜瓜N素代謝研究還停留在N營(yíng)養(yǎng)生理與果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量層面,在分子機(jī)理水平的研究報(bào)道很少,尤其是對(duì)與N素同化和利用效率緊密相關(guān)的GS酶基因的研究還是空白。因此,本文以甜瓜作為對(duì)象,在從甜瓜中克降出首個(gè)胞質(zhì)型GS基因M-GS1的基礎(chǔ)上,對(duì)M-GS1及課題組克隆到的首個(gè)甜瓜質(zhì)體型GS基因M-GS2的基因組拷貝數(shù)、表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位及生化特性、在甜瓜中的表達(dá)調(diào)控特征等進(jìn)行了研究和對(duì)比分析,從基因、蛋白質(zhì)和

3、細(xì)胞水平對(duì)甜瓜GS基因進(jìn)行了系統(tǒng)的功能驗(yàn)證和鑒定,開展了甜瓜N營(yíng)養(yǎng)代謝的分子生理研究；進(jìn)而在植株水平研究M-GS1在轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)后提高植株N素同化效率的潛能,為甜瓜GS基因的應(yīng)用、利用GS基因改良植物N素利用效率的研究提供新的材料和依據(jù)。主要研究結(jié)果如下。
　　 1、甜瓜胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　 本研究采用RACE-PCR方法從甜瓜(Cucumis melo L.var.reticulatu

4、s Naud.)品種“春麗”中克隆出首個(gè)GS1基因M-GS1(GenBank登錄號(hào):DQ851867)的全長(zhǎng)cDNA序列,并利用生物信息學(xué)手段分析其主要結(jié)構(gòu)和功能特征。該基因全長(zhǎng)1494 bp,含一個(gè)1068 bp的開放閱讀框(ORF),推測(cè)編碼一個(gè)由356個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,M-GS1與源自其它植物的GS1有較高的同源性；氨基酸序列分析顯示該蛋白具有植物GS同工酶的典型結(jié)構(gòu)特征:內(nèi)含一個(gè)GS beta-Gr

5、asp域和一個(gè)GS catalytic域,以及分別存在于這兩個(gè)域中的兩個(gè)活性中心(motif)--一個(gè)GS指紋區(qū)和一個(gè)GS ATP結(jié)合區(qū)。對(duì)M-GS1三級(jí)立體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析顯示,它與通過X光衍射鑒定的晶體GS結(jié)構(gòu)一致,其立體結(jié)構(gòu)的正確折疊需要有Mn2+、AMP及Citric acid等3個(gè)配體的存在。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,M-GS1與北美假大麻(Datisca glomerata)GS1在分子進(jìn)化關(guān)系上最相近,提示二者可能是同源進(jìn)化的結(jié)果

6、。
　　 2、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的基因組拷貝數(shù)
　　 對(duì)M-GS1及課題組克隆到的首個(gè)甜瓜質(zhì)體型GS基因M-GS2(GenBank登錄號(hào):AY773090)在甜瓜基因組中的拷貝數(shù)進(jìn)行了對(duì)比分析。Southern blot結(jié)果顯示,在甜瓜基因組中,M-GS1可能被一個(gè)由2到3個(gè)基因成員組成的基因家族所編碼,而M-GS2則由單個(gè)基因編碼。
　　 3、甜瓜谷氨酰胺合成酶的亞細(xì)胞定位
　　 通過將甜瓜M-GS

7、1及M-GS2基因分別與報(bào)告基因--黃色熒光蛋白YFP基因融合,構(gòu)建重組植物表達(dá)載體(pA7-GS1∷YFP和pA7-GS2∷YFP),應(yīng)用基因槍法轉(zhuǎn)入洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行了觀察和分析。結(jié)果顯示,融合蛋白M-GS1∷YFP定位于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,而融合蛋白M-GS2∷YFP則定位于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的質(zhì)體中。這些結(jié)果在細(xì)胞水平證實(shí)了甜瓜M-GS1和M-

8、GS2蛋白確實(shí)具有其自身所屬同工酶類別(GS1或GS2)通常所應(yīng)具有的亞細(xì)胞定位特性。
　　 4、甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的原核表達(dá)及產(chǎn)物GS酶活性相關(guān)分析
　　 為了對(duì)甜瓜M-GS1及M-GS2各自所編碼的GS酶的生化功能和屬性有準(zhǔn)確的了解,本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)M-GS1編碼區(qū)、M-GS2編碼區(qū)及去除跨肽cTP序列的M-GS2編碼區(qū)(M-GS2-cTP)成功地進(jìn)行了原核表達(dá),用Ni-NTA親和色譜法純化得到了各對(duì)應(yīng)的重組蛋白。S

9、DS-PAGE電泳結(jié)果顯示,重組M-GS1、M-GS2和M-GS2-cTP蛋白的分子量分別為41 kDa、50 kDa和44 kDa。分析各重組蛋白質(zhì)的谷氨酰胺合成酶催化特性顯示,只有重組M-GS1蛋白質(zhì)和重組M-GS2-cTP蛋白質(zhì)具有GS酶催化活性,而未切除cTP序列的重組M-GS2蛋白質(zhì)無GS催化活性；M-GS1比M-GS2-cTP具有更高的NH+4親和性和GS酶合成酶活性,但其熱穩(wěn)定性相對(duì)更低；兩種甜瓜GS酶的活性明顯受Mg2+

10、濃度的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平證實(shí)M-GS1和M-GS2為谷氨酰胺合成酶基因,而它們的表達(dá)產(chǎn)物具有各自不同的生化特性。
　　 5、不同形態(tài)N營(yíng)養(yǎng)施養(yǎng)處理對(duì)甜瓜中谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)的調(diào)控
　　 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,分析不同形態(tài)N素施養(yǎng)處理對(duì)甜瓜M-GS1及M-GS2表達(dá)的潛在調(diào)控作用。結(jié)果顯示,不同形態(tài)的N素施養(yǎng)處理對(duì)甜瓜中M-GS1及M-GS2的表達(dá)呈現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)模式。NH+4-N和NO-3-N中、低濃

11、度(3.75 mM或0.75 mM)施養(yǎng)處理僅對(duì)甜瓜葉片中M-GS2的表達(dá)有顯著的調(diào)節(jié)作用；足量的N素營(yíng)養(yǎng)濃度水平(7.5 mM)施養(yǎng)處理則對(duì)M-GS2表達(dá)量無明顯調(diào)節(jié)作用。然而,谷氨酸施養(yǎng)處理,不僅調(diào)節(jié)M-GS2在葉片中的表達(dá)(開始降低而后升高到一個(gè)比對(duì)照高的水平),還調(diào)節(jié)其在根中的表達(dá)；對(duì)甜瓜根中M-GS1表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,對(duì)其在葉片和莖中的表達(dá)則無明顯影響。NH+4-N施養(yǎng)處理能刺激M-GS1基因在甜瓜苗根、莖、葉中的表達(dá),而NO

12、-3-N則僅刺激其在甜瓜根和葉中的表達(dá)。以上結(jié)果表明,正是由于不同的GS同工酶基因有不同的表達(dá)調(diào)節(jié)特性,具有差異化的生理功能,才能保證植物在應(yīng)對(duì)現(xiàn)實(shí)生長(zhǎng)環(huán)境中不斷變化的N營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)狀況時(shí)其N素同化作用得以正常進(jìn)行。
　　 6、甜瓜M-GS1轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)對(duì)擬南芥N相關(guān)生理生化的影響
　　 將甜瓜M-GS1基因正確構(gòu)建于植物表達(dá)載體pEZT-NL中,獲得含目的基因的植物表達(dá)載體EHA105-35S∷M-GS1∷EGFP。在根

13、癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105的介導(dǎo)下,通過浸花法(Floral-dip)再將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥。通過除草劑篩選及基因組DNA PCR驗(yàn)證,獲得了十個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)M-GS1基因株系。提取獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系總RNA進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果顯示,M-GS1在各獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系中均檢測(cè)到了表達(dá)。正常(7 mM)及低N素(1mM)水平培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)M-GS1基因?qū)χ仓晟L(zhǎng)生化指標(biāo)的影響只在低N素水平