大豆種子中菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP檢測(cè)和大豆花葉病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、大豆是一種富含優(yōu)質(zhì)蛋白、無(wú)膽固醇油脂、多種糖類碳水化合物和微量物質(zhì)的雜糧作物，是飼料、油料和蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，也是用地、養(yǎng)地和保持生態(tài)平衡的重要作物。本研究以大豆為中心，在大豆上開展病毒病快速檢測(cè)技術(shù)的研究和植物病毒表達(dá)載體的構(gòu)建以用于大豆病害的防預(yù)和基因功能的研究。
　　BPMV的RT-LAMP檢測(cè):菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)是一種廣泛分布于大豆產(chǎn)區(qū)且易造成經(jīng)濟(jì)損失的災(zāi)害性病毒，在我國(guó)被列為

2、檢疫性病毒。本研究將RT-LAMP技術(shù)和RNA快速抽提法相結(jié)合，建立一種用于檢測(cè)大豆種子中BPMV的一步法RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)包括所設(shè)計(jì)的引物和優(yōu)化過的反應(yīng)體系。經(jīng)過測(cè)試，該技術(shù)能夠在大豆種子中快速、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出BPMV且無(wú)交叉反應(yīng);其最適工作溫度為62.5-65℃;可工作模板劑量范圍為0.2-1.8μL/10μL;靈敏度為BPMVRT-PCR的1000倍。因此，該技術(shù)可以作為BPMV檢驗(yàn)檢疫以及預(yù)防BPMV大規(guī)模爆發(fā)的

3、有效工具。
　　SMV表達(dá)載體的構(gòu)建:盡管已有一些不同株系的大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)表達(dá)載體被報(bào)道，但是這些SMV的基因組全長(zhǎng)都是9585bp左右，目前還沒有基因組全長(zhǎng)為9994bp左右的重組型SMV被構(gòu)建成表達(dá)載體。這種重組型SMV是2011年在南京被鑒定，其基因組5'端與菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus，BCMV)的5'端發(fā)生過重組，因此在5'端與普通SMV的5'

4、端有較大的差異，而在3'端差異較小。本研究將重組型SMV的5'端與普通SMV的3'端進(jìn)行拼接，構(gòu)建出一個(gè)嵌合式重組型SMV表達(dá)載體。并在該SMV的P1和HcPro間插入β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)，通過質(zhì)粒摩擦接種大豆30天后，在接種大豆的系統(tǒng)葉上特異地檢測(cè)到GUS染色，同時(shí)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式注射本氏煙，在接種本氏煙的系統(tǒng)葉上也特異地檢測(cè)到GUS染色。因此，本研究中所構(gòu)建的嵌合式重組型SMV表達(dá)載體可以作為基因功能研究工具在大豆、本