大白菜抗根腫病基因CRq的精細定位及克隆.pdf

1、大白菜根腫病是由根腫菌屬根腫菌侵染十字花科植株的根部引起的,該病有著十字花科作物的“癌癥”之稱。因此,挖掘抗病基因,培育抗病品種,對大白菜根腫病研究具有十分重要的意義。本研究在實驗室以大白菜抗病DH系Y635-10和感病DH系Y177-47作為研究親本,構(gòu)建F2分離群體,利用BSA-Seq和RNA-Seq對根腫病抗病基因CRq進行精細定位的基礎(chǔ)上,對CRq進行了克隆,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物過表達載體,對擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化,并對

2、轉(zhuǎn)基因植株進行了抗病性鑒定,主要得到以下結(jié)果:
　　1.在河南省農(nóng)科院園藝所新野縣根腫病實驗基地對構(gòu)建的F2分離群體進行春、秋兩季的抗病性鑒定試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2分離群體的抗病、感病植株的分離比例約為3∶1,根據(jù)孟德爾遺傳定律對抗性鑒定結(jié)果進行分析,判斷大白菜根腫病抗性為一個主效基因控制。
　　2.在F2分離群體表型鑒定的基礎(chǔ)上,依據(jù)抗病、感病的表型的差異,選取極端抗、感表型的個體及親本,構(gòu)建2個測序深度為10x的親本DNA池和

3、2個測序深度為50x的F2分離群體極端抗、感DNA池,進行BSA-Seq分析,將抗性基因初步定位于A03染色體的24.30-24.75區(qū)域(450Kb)。通過加密標記的方式,在該區(qū)域設(shè)計了298個SSR標記和365個InDel標記,將候選區(qū)間精細到24.30-24.55Mb(250Kb)。
　　3.結(jié)合大白菜的參考基因組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)存在4個抗病基因,之后將4個R基因序列與RNA-Seq時親本De novo組裝數(shù)據(jù)比對分析,

4、發(fā)現(xiàn)這4個R基因均比對到了抗病材料Y635-10中組裝的Unigene16741。因此,推測Unigene16741可能是大白菜抗根腫病基因CRq的部分片段,并利用RACE技術(shù)克隆CRq基因cDNA全長。
　　4.利用Gateway技術(shù)構(gòu)建CRq基因的植物過表達載體,對擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化,并對T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行抗病性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在根腫菌侵染處理后,與轉(zhuǎn)基因植株相比,野生型擬南芥的根部明顯膨大,說明轉(zhuǎn)基因擬南芥具有一定抗性。因