心肌梗死后心肌重塑干預(yù)靶點及其分子機(jī)制研究.pdf

1、本文分為兩個部分進(jìn)行探討：
　　論文Ⅰ 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在心肌梗死后心肌纖維化中的作用及其機(jī)制研究
　　目的：
　　1.研究心肌組織中TSLP在小鼠MI后心肌纖維化中的作用及其分子機(jī)制;
　　2.研究TSLP對小鼠MI后心功能的影響;
　　3.研究TSLP對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成能力的影響;
　　方法：
　　1.慢病毒shRNA-TSLP載體構(gòu)建:
　　

2、構(gòu)建3種干擾TSLP表達(dá)的慢病毒載體，以攜帶亂序shRNA的慢病毒載體作為干擾空白對照。分別轉(zhuǎn)染小鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，選擇干擾效率最高的慢病毒為后續(xù)實驗使用。
　　2.動物模型的建立及慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染
　　8周齡C57小鼠(20-25g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，在2％異氟烷麻醉下，于胸骨左緣第4肋間開胸，將小鼠心臟擠出胸腔，用7.0號無損傷線結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)，結(jié)扎線以下小鼠心肌組織變白，室壁活動強(qiáng)度減弱，證明結(jié)扎成

3、功。結(jié)扎LAD后，將25μL攜帶1×107 UT的TSLP干擾序列慢病毒或?qū)φ战M慢病毒溶液分別分3點注射到心臟結(jié)扎部位周圍心肌組織中。術(shù)畢，將小鼠心臟還納回胸腔，擠壓掉胸腔中的空氣，關(guān)胸。術(shù)后4周，行心肌組織快速冰凍切片并置于顯微鏡下觀察病毒的轉(zhuǎn)染效率。留取心肌組織并在蛋白水平檢測TSLP的表達(dá)以確定抑制效果。
　　3.心臟功能的測定
　　采用心臟二維超聲及M超成像技術(shù)，通過測定左室收縮/舒張末期直徑，左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸

4、縮短率評價小鼠心臟功能。
　　4.組織學(xué)染色
　　收集各組小鼠心臟，制備石蠟切片，進(jìn)行HE，Masson和天狼星紅染色分別顯示各組小鼠心臟的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)、梗死面積及心肌內(nèi)膠原的含量。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察心肌組織中TSLP、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達(dá)情況。
　　5.細(xì)胞培養(yǎng)
　　本實驗采用新生1-3天的昆明小鼠乳鼠心臟分離和培養(yǎng)原代心肌成纖維細(xì)胞。根據(jù)實驗?zāi)康模瑧?yīng)用AngⅡ、TSLP重組蛋白及TSL

5、P中和抗體等刺激成纖維細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增值、遷移及膠原合成能力的影響。
　　6.細(xì)胞免疫熒光檢測
　　應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞中TSLP及其受體TSLPR和IL-7Rα的分布及表達(dá)。
　　7.蛋白印跡(Western blot)
　　收集各組組織及細(xì)胞，提取蛋白，分別檢測TSLP、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、t-STAT3、p-STAT3、t-ERK、p-ERK、t-JNK、p-JNK、p38及p-p3

6、8等蛋白表達(dá)水平。
　　8.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)
　　測定各組細(xì)胞上清及各組小鼠血清中TSLP水平。
　　9.細(xì)胞增殖和遷移實驗
　　采用CCK8及EDU細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測心肌成纖維細(xì)胞增殖情況。應(yīng)用Transwell小室檢測心肌成纖維細(xì)胞的遷移能力。
　　10.統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。
　　結(jié)果：
　　1

7、.MI引起心肌組織中TSLP表達(dá)增加，且慢病毒轉(zhuǎn)染后抑制效果顯著
　　Western blot及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，梗死周圍區(qū)心肌組織中，TSLP表達(dá)增加。與轉(zhuǎn)染對照組慢病毒相比，轉(zhuǎn)染攜帶干擾TSLP序列的慢病毒組小鼠心肌組織中TSLP表達(dá)明顯降低。
　　2.抑制TSLP可顯著改善MI后心功能異常
　　MI模型建立4周后，心臟超聲結(jié)果顯示左室內(nèi)徑增大，EF及FS較正常小鼠明顯降低，提示小鼠心功能減退，而抑制TSL

8、P后心功能明顯改善。
　　3.抑制TSLP明顯減輕MI誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　Masson染色及天狼星紅染色均提示MI后心肌組織發(fā)生明顯的纖維化。Western blot及免疫組織化學(xué)染色顯示心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著增高，而抑制TSLP后心肌纖維化程度明顯減輕。
　　4.TSLP促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成
　　細(xì)胞免疫熒光染色證實心肌成纖維細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)TSLP及其受體復(fù)

9、合物。應(yīng)用不同濃度TSLP重組蛋白(5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml)刺激心肌成纖維細(xì)胞24h后結(jié)果顯示，與正常對照組相比，TSLP促進(jìn)了心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白的表達(dá)。EdU及CCK8檢測細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TSLP重組蛋白刺激可明顯增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。Tranwell實驗結(jié)果顯示，TSLP重組蛋白刺激促進(jìn)了細(xì)胞遷移。
　　5.AngⅡ促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)TSLP，抑制TSLP

10、可減輕AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及膠原合成
　　應(yīng)用不同濃度的AngⅡ刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AngⅡ劑量依賴性地促進(jìn)了TSLP的表達(dá)和分泌。應(yīng)用TSLP中和抗體預(yù)處理細(xì)胞，可明顯減輕AngⅡ誘導(dǎo)的膠原的合成及TGF-β1表達(dá)增加，同時細(xì)胞增殖也受到明顯抑制。
　　6.TSLP促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞中STAT3及MAPK(JNK、ERK、p38)信號通路的磷酸化水平
　　TSLP重組蛋白及AngⅡ刺激均可明顯增加心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)STAT

11、3、MAPK(JNK、ERK、p38)的磷酸化水平。抑制TSLP后上述分子磷酸化水平明顯降低，提示STAT3、MAPK(JNK、ERK、p38)信號通路的激活參與了TSLP介導(dǎo)的MI后心肌纖維化的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.心肌梗死后，TSLP表達(dá)增加，抑制TSLP可改善心肌纖維化及心功能障礙;
　　2.TSLP可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞遷移、增殖及合成膠原;
　　3.AngⅡ可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成和分泌TSLP，阻

12、斷TSLP可明顯減輕AngⅡ?qū)π募±w維化的影響;
　　4.TSLP介導(dǎo)心肌梗死后心肌纖維化的機(jī)制可能與STAT3及MAPK信號通路的激活有關(guān)。
　　論文Ⅱ SIRT1介導(dǎo)姜黃素在心梗后心肌重塑中保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　目的：
　　1.建立小鼠心肌梗死模型，明確姜黃素對心梗后心肌重塑的保護(hù)作用并初步探討SIRT1活化在姜黃素心肌保護(hù)中作用;
　　2.體外研究中，明確SIRT1在心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化中的作用

13、;
　　方法：
　　1.動物模型的建立
　　8周齡C57小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將動物隨機(jī)分為四組:假手術(shù)組(sham)、假手術(shù)+姜黃素100 mg/kg(sham+Cur)、心梗模型組(MI)、心梗模型+姜黃素100 mg/kg組(MI+Cur)。1周后，在2％異氟烷麻醉下，開胸，將小鼠心臟擠出胸腔，結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)，術(shù)畢，將小鼠心臟還納回胸腔，擠壓掉胸腔中的空氣，關(guān)胸。
　　2.心臟功能的測定<

14、br>　　采用心臟二維超聲及M超成像技術(shù)，通過測定左室收縮/舒張末期直徑，左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率評價小鼠心臟功能。
　　3.組織學(xué)染色
　　收集各組小鼠心臟，制備石蠟切片，進(jìn)行HE，Masson和天狼猩紅染色。HE染色用于評估心臟大體形態(tài)及心肌細(xì)胞直徑的變化。Masson和天狼星紅染色用于評價膠原沉積情況及計算心肌梗死面積。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察心肌組織中SIRT1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。<

15、br>　　結(jié)果：
　　1.姜黃素減輕了心梗后心肌重塑
　　與假手術(shù)組相比，心梗后，心臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為心身重量比(HW/BW)增加，左室明顯擴(kuò)張，鏡下觀察，HE染色顯示心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，細(xì)胞間隙增加;Masson染色及天狼猩紅染色結(jié)果顯示心梗后心肌組織中膠原沉積增加，膠原排列紊亂;免疫組織化學(xué)染色顯示心梗后小鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β1表達(dá)增加。Western blot結(jié)果顯示心肌組織中炎

16、癥反應(yīng)標(biāo)志物IL-6、TNF-α及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2,caspase3表達(dá)增加，與免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色結(jié)果一致。姜黃素干預(yù)治療顯著改善了心梗后心肌重塑。同時Western blot及免疫組織化學(xué)染色證實姜黃素增加了心肌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)。
　　2.姜黃素改善了心梗后左室功能障礙
　　心梗后4周，超聲檢測小鼠心功能發(fā)現(xiàn)，MI組小鼠心功能顯著降低，具體表現(xiàn)為左室內(nèi)徑增大，EF及FS較正常小數(shù)明

17、顯降低，而姜黃素干預(yù)治療顯著改善心梗小鼠左室功能障礙。
　　3.姜黃素預(yù)處理減少了AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡
　　100 nmol/L AngⅡ刺激H9C2心肌細(xì)胞48小時后， Western Blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白caspase3表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2比值顯著增加;姜黃素預(yù)處理劑量依賴性的減輕了上述變化，同時發(fā)現(xiàn)姜黃素促進(jìn)了細(xì)胞中SIRT1表達(dá)，并降低下游Ac-FOXO1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論