真核原核表達(dá)UHRF2各結(jié)構(gòu)域突變體蛋白.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建UHRF2不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體表達(dá)載體并在真核細(xì)胞中表達(dá)；構(gòu)建UHRF2各個(gè)以結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)的突變體原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)并對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和鑒定；為進(jìn)一步研究UHRF2與其它蛋白相互作用位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　真核表達(dá)產(chǎn)物采用缺失體構(gòu)建策略，根據(jù)UHRF2不同結(jié)構(gòu)域位置特征，單個(gè)結(jié)構(gòu)域逐一缺失和兩個(gè)結(jié)構(gòu)域同時(shí)缺失，構(gòu)建5種不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體；以重組質(zhì)粒pCMV-3xFlag-UHRF

2、2為模板，PCR法直接擴(kuò)增獲得△UBL、△RING和△YDG+△RING編碼基因，重疊PCR法擴(kuò)增獲得△=PHD和△YDG編碼基因；雙酶切目的基因片段，定向克隆至pCMV-3xFlag真核表達(dá)載體中，構(gòu)建相應(yīng)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，雙酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Western blot鑒定產(chǎn)物表達(dá)情況。
　　原核表達(dá)UHRF2的各個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白，采用直接GST融合各個(gè)結(jié)構(gòu)域的策略。以pCMV-3x

3、Flag-UHRF2為模板，PCR擴(kuò)增UHRF2的各個(gè)結(jié)構(gòu)域，各PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接到pGEX-4T-1載體上。用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21菌株)，IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)GST融合蛋白，超聲破碎細(xì)菌，離心收獲蛋白并經(jīng)Glutathione Sepharose4B球珠親合純化。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印記實(shí)驗(yàn)鑒定各蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　真核構(gòu)建的各個(gè)缺失體載體經(jīng)酶切和測(cè)序確認(rèn)，

4、載體構(gòu)建正確；各重組載體在轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，經(jīng)免疫印記檢測(cè)顯示UHRF2的各個(gè)結(jié)構(gòu)缺失體成功表達(dá)。原核構(gòu)建的各個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白表達(dá)載體經(jīng)酶切和測(cè)序確認(rèn)，載體構(gòu)建正確；各重組載體經(jīng)大腸桿菌BL21菌株表達(dá)，純化的蛋白經(jīng)蛋白電泳后考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印記分析后顯示各融合蛋白成功表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　UHRF2各結(jié)構(gòu)域缺失體的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功便于細(xì)胞內(nèi)研究UHRF2各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能、UHRF2與其它蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)相互