Necrostatin-1保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制研究.pdf

1、背景：谷氨酸廣泛的參與了生物體能量代謝及神經(jīng)傳導(dǎo)的過程。維持正常生理功能十分重要的氨基酸。谷氨酸在體內(nèi)代謝功能的紊亂會(huì)引起多種疾病的發(fā)生。然而對其在體內(nèi)產(chǎn)生的毒性的具體機(jī)制研究還不是很清楚。
　　目的：研究necrostatin-1與受體相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase1,RIP1)及受體相互作用蛋白激酶3(receptor interaction protein kina

2、se3,RIP3)在谷氨酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)與海馬神經(jīng)元(HT22)毒性中發(fā)揮的作用。
　　方法：在用谷氨酸或TNF-誘導(dǎo)后,檢測野生型及RIP3缺失型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)以及 HT22細(xì)胞的存活率,以探明它們對谷氨酸或TNF-的敏感度。通過siRNA干擾將TNF-誘導(dǎo)的壞死通路中的關(guān)鍵蛋白 RIP1沉默,或通過藥物necrostatin-1預(yù)處理,后加入谷氨酸或TNF-?誘導(dǎo),觀察RIP1的下調(diào)與 nec

3、rostatin-1預(yù)處理對谷氨酸或 TNF-?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響是否一致。并用western blot檢測其siRNA的干擾效率。利用RIP3缺失的MEF細(xì)胞,以及通過用siRNA干擾降低 RIP3表達(dá)的HT22細(xì)胞,檢測 RIP3的缺失或下調(diào)對谷氨酸或TNF-?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響,以判斷TNF-?誘導(dǎo)壞死的關(guān)鍵蛋白R(shí)IP3是否參與谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)通路。通過siRNA干擾的方法下調(diào)線粒體蛋白凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis

4、 inducing factor,AIF)的表達(dá),以判斷AIF在谷氨酸或TNF-?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用;通過使用自噬及溶酶體的化學(xué)抑制劑 balfilomycin-A1(BFA),Chloroquine(CQ),3-Methyladenine(3-MA)以及活性氧ROS的化學(xué)抑制劑butylated hydroxyanisole(BHA),N-acetylcysteine(NAC)以判斷谷氨酸或TNF-?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自噬或溶酶體及

5、活性氧的關(guān)系。
　　結(jié)果：⑴在HT22和MEF細(xì)胞中,necrostatin-1都能夠有效阻止谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,而且凋亡抑制蛋白z-VAD能促進(jìn)此細(xì)胞死亡。⑵在MEF和HT22細(xì)胞中,利用RNAi沉默necrostatin-1的靶蛋白R(shí)IP1能夠抑制腫瘤壞死因子TNF-?誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死,但不影響谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。⑶與RIP1相互作用的細(xì)胞壞死調(diào)控蛋白R(shí)IP3的敲除不能抑制谷氨酸誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞死亡,但能完全阻止 TNF-誘

6、導(dǎo)的細(xì)胞壞死,而且,RIP3的RNAi不能抑制谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡。⑷線粒體凋亡誘導(dǎo)因子AIF的沉默不能阻止谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡以及MEF細(xì)胞死亡。⑸自噬/溶酶體抑制劑BFA和3-MA等能有效阻止谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,但不影響TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。⑹活性氧抑制劑BHA和NAC能抑制谷氨酸以及TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。
　　結(jié)論：證實(shí)了necrostatin-1阻止谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的靶點(diǎn)并不是RIP1,同時(shí)也提出