仿刺參微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的篩選與應(yīng)用及性別差異研究初探.pdf

1、1.利用FIASCO的方法構(gòu)建了刺參(CA)n的微衛(wèi)星DNA富集文庫，檢測結(jié)果證明該微衛(wèi)星DNA文庫的富集效率為56.3％。測序得到110條含有微衛(wèi)星DNA的序列的克隆，共得到118個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)，其中完美型的微衛(wèi)星DNA共83個(gè)，占70.4％；非完美型的微衛(wèi)星DNA共30個(gè)，占25.4％；復(fù)合型的微衛(wèi)星DNA共5個(gè)，占4.2％。重復(fù)次數(shù)在5～9次之間的有88個(gè)，占73.5％，重復(fù)次數(shù)在10次以上的有29個(gè)，占24.8％。根據(jù)所分離

2、的微衛(wèi)星DNA序列，共設(shè)計(jì)了84對引物。結(jié)果表明FIASCO方法可以較好的應(yīng)用于刺參微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的分離。這些微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的獲得將為刺參群體遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 2.利用設(shè)計(jì)的20對微衛(wèi)星DNA標(biāo)記引物對采自中國青島、韓國木浦、韓國江陵、日本新瀉以及俄羅斯海明崴5個(gè)地理群體的仿刺參以及美國沿海的八角參進(jìn)行了微衛(wèi)星DNA多態(tài)性篩選、遺傳多樣性水平以及遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果

3、表明，20個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性，共檢測出231個(gè)等位基因，各位點(diǎn)分別擴(kuò)增得到3～20個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為11.6個(gè)。20個(gè)位點(diǎn)在6個(gè)群體中不同程度的偏離遺傳平衡(p<0.05)，所有群體在整體上均表現(xiàn)為雜合子缺失(Fis>0)；5個(gè)仿刺參群體間的遺傳相似系數(shù)在0.71以上，相似性較高，而仿刺參群體與八角參的相似性則較低。聚類分析結(jié)果表明，中國群體與韓國西海岸群體聚類成一支，而俄羅斯群體、韓國東海岸群體和日本群體聚類成另

4、外一支，聚類的先后與它們在地理分布上的海域位置有一定的相關(guān)性。本研究所篩選的多態(tài)性微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記將為刺參群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、刺參遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種研究提供基礎(chǔ)。此外，不同群體刺參遺傳結(jié)構(gòu)的解析結(jié)果也為刺參良種選育相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 3.用攻毒的方法選出感病刺參和抗病刺參各15頭，組成感病群體和抗病群體。用20對微衛(wèi)星引物對兩個(gè)群體刺參個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，卡方檢驗(yàn)各等位基因在兩個(gè)群體間出現(xiàn)頻數(shù)

5、的差異，得到與抗病正相關(guān)的特異性遺傳標(biāo)記3個(gè)，與抗病負(fù)相關(guān)的特異性遺傳標(biāo)記3個(gè)。用13對多態(tài)性引物對兩個(gè)群體的遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)群體的遺傳多樣性水平均較高，抗病群體的遺傳多樣性水平要高于感病群體。兩個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)為0.0478，說明兩個(gè)群體間存在輕度的遺傳分化；兩個(gè)群體間的遺傳距離為0.1685，遺傳相似性指數(shù)為0.8449。這些抗病相關(guān)的遺傳標(biāo)記將為刺參分子輔助育種提供數(shù)據(jù)支持。
　　

6、4.在刺參生殖季節(jié)采集刺參，采用組織學(xué)研究方法，以刺參體壁樣品為對照，觀察了雌雄刺參生殖孔及周圍的肌肉組織，在雄參和雌參生殖孔及周圍肌肉的橫切及縱切切片中均發(fā)現(xiàn)了生殖管。雌雄刺參的生殖管在直徑大小、橫切形狀及周圍組織結(jié)構(gòu)3方面均有不同。雄參的生殖管直徑小，橫切形狀為圓形或心形，周圍沒有纖維狀組織；刺參的生殖管直徑大，橫切形狀為梭形，較大的生殖管周圍有纖維狀組織。本研究的發(fā)現(xiàn)為刺參性別鑒定技術(shù)提供了參考，為刺參生殖孔的形成以及性別分化機(jī)制

7、等研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.利用AFLP技術(shù)，應(yīng)用96對AFLP引物組合，對刺參雌雄基因組DNA進(jìn)行檢測，篩選與刺參性別相關(guān)的分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中共擴(kuò)增出2753個(gè)位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)性別相關(guān)的特異性標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了212個(gè)位點(diǎn)在雌性和雄性個(gè)體中出現(xiàn)的比例存在很大差異(大于50％)，用這212個(gè)位點(diǎn)繪制刺參個(gè)體聚類圖，表明這212個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與刺參性別之間存在很大的相關(guān)性。本研究所積累的大量AFLP分析結(jié)果和數(shù)據(jù)，可作為刺參遺傳背景資料，為刺參