人甲狀旁腺素在甲醇畢赤酵母中的表達.pdf

1、甲狀旁腺素是由甲狀旁腺分泌的含有84個氨基酸的直鏈肽,是調(diào)節(jié)體液鈣磷代謝的主要激素.人甲狀旁腺素的主要生理作用是通過調(diào)節(jié)骨細胞及腎細胞的功能來維持血鈣平衡,臨床上可治療骨質(zhì)疏松癥.甲狀旁腺素作為新型轉(zhuǎn)基因藥物在治療骨質(zhì)疏松癥方面具有普通補鈣藥物不可比擬的作用,具有廣泛的市場前景.該論文概述了甲狀旁腺素在國內(nèi)外的研究情況,并介紹了近年來發(fā)展較快的真核表達系統(tǒng)-甲醇畢赤酵母系統(tǒng),來論證構(gòu)建重組人甲狀旁腺素酵母表達體系的重要性.該研究通過構(gòu)建

2、重組人甲狀旁腺素表達載體,將其轉(zhuǎn)入甲醇畢赤酵母中進行誘導表達.論文選用酵母偏愛的密碼子,人工合成長度為282bp的人甲狀旁腺素(hPTH)基因.將合成的基因克隆于M13載體上,DNA測序驗證正確.根據(jù)資料設(shè)計PTH的引物,進行PCR反應,擴增出目的基因片段PTH,將其分離純化后,與表達質(zhì)粒pPIC9K重組并轉(zhuǎn)化E.coliTop10F,對重組子進行篩選鑒定.分泌表達載體的構(gòu)建完成之后,將含目的基因的表達載體線形化,并電轉(zhuǎn)化到畢赤氏酵母中

3、.應用His<'+>表型和G418抗性來篩選含多拷貝插入的重組子,進行重組子的Mut<'+>和Mut<'s>表型鑒定,得到含編碼hPTH基因的構(gòu)建菌.初步研究重組子的誘導表達,對表達蛋白進行Tricine-SDS-PAGE電泳檢測,在9.3kDa處有明顯的誘導蛋白帶,與設(shè)計的目的蛋白的分子量相近,同時通過酶聯(lián)免疫沉淀法檢測(ELISA)72hr誘導的上清液具有0.132ng/ml的免疫學活性,表明成功地構(gòu)建了含甲狀旁腺素基因的畢赤氏酵母