齊墩果酸對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中血紅素氧合酶1表達(dá)的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠心病是當(dāng)今全世界危害人們身體健康最常見(jiàn)的心臟病，位列我國(guó)心臟病住院率和死亡率之首。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要病理生理變化，動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展程度，特別是易損斑塊的破裂是急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）、冠心病猝死等急性冠心病事件的主要“導(dǎo)火線”。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞，其不正常地增殖、遷移及凋亡貫穿動(dòng)脈粥樣硬化的全過(guò)程。因此，如何有效地調(diào)節(jié)VSMCs的生理功能，已成為目前關(guān)心的熱點(diǎn)問(wèn)題

2、。
　　 齊墩果酸（Oleanolic acid, OA）是從天然產(chǎn)物中提取出來(lái)的五環(huán)三萜類化合物，在我國(guó)，齊墩果酸主要用于急慢性肝炎的治療。目前，國(guó)外研究表明：OA 除對(duì)肝臟有保護(hù)作用外，在心血管系統(tǒng)也發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如保護(hù)心肌免于缺血再灌注損傷，調(diào)節(jié)血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。但是其作用的具體機(jī)制仍不甚清楚。血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）是機(jī)體最重要的抗氧化酶之一，正常情況下在組織中

3、不或者低表達(dá)，當(dāng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)，其表達(dá)會(huì)上調(diào)，從而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，激活HO-1能調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的功能，保護(hù)其免于各種不利刺激的損傷。最近國(guó)內(nèi)外研究更表明，HO-1也參與了多種治療心血管疾病藥物的作用。因此，本課題以VSMCs為研究對(duì)象，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討OA是否通過(guò)調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)血管的作用，并探討其可能的機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 第一部分齊墩果酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中血紅素氧

4、合酶1表達(dá)的影響及與PI3K、MAPK通路的關(guān)系。
　　 取SD 雄性大鼠，經(jīng)手術(shù)取其胸主動(dòng)脈，采用貼塊法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，采用α-SM-actin 特異性抗體行細(xì)胞鑒定為平滑肌細(xì)胞，4-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將VSMCs分為：
　　 ①正常對(duì)照組，② OA （10μM）組，③ OA （25 μM）組，④ OA （50μM）組；然后放入孵箱中培養(yǎng)12小時(shí)，后取出采用RT-PCR及Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中HO-1

5、mRNA及蛋白表達(dá)情況，分光光度法測(cè)定HO-1活性。然后取OA 最佳濃度加入VSMCs中，放入孵箱中培養(yǎng)指定時(shí)間后取出，采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)。
　　 將VSMCs分為：正常對(duì)照組和OA不同時(shí)間作用組，提取細(xì)胞蛋白，采用Wes t er nblot 法檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化Akt及磷酸化MAPKs的表達(dá)情況。通過(guò)上一步實(shí)驗(yàn)確定能被OA 激活的激酶，在下一步實(shí)驗(yàn)中采用相應(yīng)的阻斷劑與OA作用于細(xì)胞，分為：①

6、正常對(duì)照組，② OA組，③ OA+相應(yīng)阻斷劑組。干預(yù)后放入孵箱中培養(yǎng)指定時(shí)間后，取出提取蛋白，行Western blot 法檢測(cè)HO-1的表達(dá)。
　　 第二部分轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在齊墩果酸調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞血紅素氧合酶1表達(dá)中的作用。
　　 將VSMCs分為：①正常對(duì)照組，② OA （10μM）組，③ OA （25 μM）組，④ OA（50μM）組；在孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)候后取出，提取細(xì)胞核蛋白，Western blot 檢測(cè)

7、細(xì)胞核中Nf2的表達(dá)變化。確定OA能激活Nrf2后，加入相應(yīng)阻斷劑，實(shí)驗(yàn)分為：①正常對(duì)照組，② OA組，③ OA+相應(yīng)阻斷劑組。在孵箱中培養(yǎng)指定時(shí)間后，取出提取細(xì)胞核蛋白，行EMSA 檢測(cè)Nrf2 結(jié)合活性。
　　 將構(gòu)建好的Nrf2 干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot 測(cè)定Nrf2的表達(dá)，確定是否干擾成功。將VSMCs分為：①對(duì)照載體轉(zhuǎn)染組，② OA+對(duì)照載體轉(zhuǎn)染組，③ Nrf2干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組，④ OA+N

8、rf2 干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組。采用Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)變化。
　　 第三部分齊墩果酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制實(shí)驗(yàn)先采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT）確定過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞損傷的最佳濃度，然后實(shí)驗(yàn)分為：①正常對(duì)照組，②H2O2組，③ OA+H2O2組，④ OA+H2O2+ZnPP組，⑤ OA+H2O2+相應(yīng)阻斷劑組。采用MTT、Hoechst333

9、42 法或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及壞死情況。
　　 然后將實(shí)驗(yàn)分為：①正常對(duì)照組，②過(guò)氧化氫（H2O2）組，③ OA （10μM）+H2O2組，④ OA （25 μM）+H2O2組，⑤ OA （50μM）+H2O2組。采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及超氧化物歧化酶（SOD）的變化。
　　 研究結(jié)果：
　　 （1）OA在10、25、50μM濃度范圍內(nèi)都能上調(diào)

10、VSMCs中HO-1的活性、mRNA及蛋白水平，呈現(xiàn)濃度依賴性，并且在50μM濃度時(shí)，OA 誘導(dǎo)VSMCs中HO-1表達(dá)的作用最強(qiáng)，故此以后實(shí)驗(yàn)均采用50μM濃度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。
　　 （2）OA作用于VSMCs不同時(shí)間后，HO-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不同程度地上調(diào)，6小時(shí)時(shí)HO-1表達(dá)最強(qiáng)，隨后，HO-1蛋白表達(dá)逐漸減弱。
　　 （3）OA作用于VSMCs后，能使細(xì)胞中磷酸化的Akt、ERK及p38 激酶表達(dá)增強(qiáng)。
　　

11、 細(xì)胞分別經(jīng)PI3K 抑制劑wortmannin，ERK 抑制劑PD98059及p38 抑制劑SB203850預(yù)處理后，Western blot 顯示wortmannin及PD98059 預(yù)處理組較單純OA組的HO-1表達(dá)顯著下調(diào)；SB203850預(yù)處理組的HO-1表達(dá)與單純OA組比無(wú)顯著變化。
　　 （4）不同濃度的OA作用于VSMCs 4小時(shí)，能激活細(xì)胞中Nrf2的核轉(zhuǎn)錄，且呈現(xiàn)濃度依賴性。細(xì)胞分別經(jīng)wortmannin及P

12、D98059 預(yù)處理后，與單純OA組比較，細(xì)胞中Nrf2 結(jié)合活性顯著減弱。
　　 （5）Nrf2 干擾慢病毒成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMCs，Nrf2 siRNA 轉(zhuǎn)染組與control siRNA組比較，細(xì)胞核Nrf2表達(dá)顯著減弱；OA+Nrf2 siRNA組與OA+control siRNA組比較，HO-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　 （6）不同濃度的H2O2作用于VSMCs 24小時(shí)，能導(dǎo)致細(xì)胞不同程度的死亡，并呈現(xiàn)濃度依賴性

13、，當(dāng)濃度達(dá)到400μM時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性作用，故此以后實(shí)驗(yàn)采用400μM H2O2作用于細(xì)胞。與H2O2組比較，OA 各劑量組細(xì)胞GSH、NADPH及SOD含量均有不同程度的上升，其中25、50μM組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與OA+H2O2組相比，經(jīng)ZnPP （HO-1活性抑制劑）、wortmannin及PD98059 預(yù)處理組，細(xì)胞活性顯著降低。
　　 結(jié)論：
　　 （1）OA能上調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中HO-1的mRNA

14、及蛋白表達(dá)，伴有HO-1活性的增強(qiáng)。
　　 （2）OA通過(guò)激活大鼠血管平滑肌細(xì)胞Akt、ERK通路誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。
　　 （3）OA能激活大鼠血管平滑肌細(xì)胞中Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子，Akt及ERK通路參與其中。
　　 （4）Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子參與了OA 誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)。
　　 （5）OA能減輕H2O2導(dǎo)致的大鼠血管平滑肌細(xì)胞氧化損傷，可能是通過(guò)增加HO-1等抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 由此