人白細(xì)胞介素４在衣藻葉綠體中的高效轉(zhuǎn)化及表達(dá).pdf

1、葉綠體轉(zhuǎn)化是近些年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)環(huán)境友好的基因工程技術(shù)，由于葉綠體基因組的高度多倍性，葉綠體轉(zhuǎn)化允許每個(gè)細(xì)胞中導(dǎo)入近百到數(shù)千個(gè)拷貝的外源基因，并表達(dá)較高水平的外源蛋白。近幾年來(lái)，盡管高等植物葉綠體表達(dá)系統(tǒng)也成功地高表達(dá)了數(shù)種蛋白質(zhì)藥物，如人生長(zhǎng)激素、人血清白蛋白、人胰島素、口服疫苗等，但由于植物葉綠體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物再生障礙、以及植物代謝產(chǎn)物復(fù)雜而不利于提取純化等問(wèn)題，使得該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用受到限制。因此，人們把研究的目標(biāo)轉(zhuǎn)向萊茵哈德衣藻的

2、葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 本文利用PCR融合技術(shù)將人白細(xì)胞介素4基因(hIL4)融合到萊茵哈德衣藻葉綠體基因組rbcL 5’-UTR和3’-UTR非翻譯區(qū)序列之間，得到了5’UTR-hIL4-3’UTR融合表達(dá)單元；然后將其插入到來(lái)源于萊茵哈德衣藻葉綠體基因組5.7Kb的同源片段中，構(gòu)建成pXhIL4同源重組交換質(zhì)粒；利用電脈沖法將pXhIL4質(zhì)粒與含有aadA基因的壯觀霉素抗性質(zhì)粒p228共同轉(zhuǎn)化萊茵哈德衣藻葉綠體。 本實(shí)驗(yàn)研

3、究了萊茵哈德衣藻的生長(zhǎng)條件、生理特性以及在電脈沖轉(zhuǎn)化中所需的化學(xué)、物理參數(shù)及其與轉(zhuǎn)化效率的相關(guān)性，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選與檢測(cè)，初步探討了外源基因在萊茵哈德衣藻葉綠體中的同質(zhì)化進(jìn)程。從含有100ug/ml的壯觀霉素抗性平皿上篩選到陽(yáng)性藻落，并通過(guò)PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)到hIL4基因，檢測(cè)結(jié)果顯示，其共轉(zhuǎn)化頻率高達(dá)90％。經(jīng)過(guò)Western blotting印跡轉(zhuǎn)移分析，證實(shí)了人白細(xì)胞介素4基因在轉(zhuǎn)基因萊茵哈德衣藻藻株中成功獲得表達(dá)。 本文