Notch信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用及機(jī)制研究.pdf

1、小膠質(zhì)細(xì)胞是19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的繼神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)第四類細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)廣泛分布，約占膠質(zhì)細(xì)胞總量的5％-20％。目前對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源仍存在爭(zhēng)議，廣為接受的學(xué)說(shuō)認(rèn)為其起源于卵黃囊的血島及血液中的單核細(xì)胞。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅參與神經(jīng)發(fā)生的生理過(guò)程，而且在神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)損傷以及腫瘤等多種病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中，靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞

2、為分支狀，胞體小，具有伸向各個(gè)方向的細(xì)胞突起，用以檢測(cè)周圍環(huán)境的變化。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞飲功能和一定的遷移能力，可清除代謝產(chǎn)物及神經(jīng)元正常重塑過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，還可分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)元的存活。當(dāng)外源性物質(zhì)入侵，發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞立即激活，并發(fā)生明顯的形態(tài)改變:其分支狀突起變粗變短，形成灌木樣，進(jìn)而胞體變圓、突起消失，成為“阿米巴樣”。阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力，其功能類似于單核巨噬細(xì)胞，在中樞神

3、經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮重要的免疫效應(yīng)。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)，β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)，低氧，促炎性因子等均可誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)損傷的發(fā)生與進(jìn)展。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞免疫表型與功能發(fā)生明顯變化。首先，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ類抗原表達(dá)明顯增加，分泌大量的炎性因

4、子，如白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、前列腺素(prostaglandin，PG)、反應(yīng)氧簇(reactive oxygen species，ROS

5、)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和興奮性氨基酸等。這些免疫效應(yīng)分子可以通過(guò)不同的途徑作用于神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞等，直接導(dǎo)致靶細(xì)胞的凋亡。炎性因子還可以作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的釋放，并反饋性的加劇小膠質(zhì)細(xì)胞自身炎性反應(yīng)的發(fā)生。其次，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞還可以分泌與遷移相關(guān)的趨化因子，并且上調(diào)表達(dá)趨化因子受體，從而介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向損傷部位遷移，加重?fù)p傷區(qū)域炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。與此同時(shí)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞加速增殖，進(jìn)

6、一步促進(jìn)損傷區(qū)域炎癥反應(yīng)的發(fā)生。總之，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)以上行為的改變，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷及疾病的發(fā)生與進(jìn)展。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減輕炎癥反應(yīng)，已成為防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要策略。只有闡明小膠質(zhì)細(xì)胞的激活機(jī)制，才能實(shí)現(xiàn)針對(duì)性的抑制其活化。目前關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活機(jī)制研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)，絲裂原蛋白激酶通路(MAPKs)等多個(gè)信號(hào)通路均有參與，但是其具體的機(jī)制仍不清楚。因

7、此闡明小膠質(zhì)細(xì)胞激活機(jī)制，是實(shí)現(xiàn)抗炎治療的前提與研究重點(diǎn)。
　　Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是調(diào)控胚胎發(fā)育的重要信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物表達(dá)四個(gè)Notch受體(Notch1-4)和五個(gè)配體(Jagged1、2和Delta-like-1、3、4)。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過(guò)相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過(guò)三次剪切，釋放胞內(nèi)段(intracellular Notch receptor domain

8、，NICD)入胞質(zhì)，NICD進(jìn)而轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合，形成NICD/RBP-Jκ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Notch信號(hào)通路可以調(diào)控多種器官的發(fā)生。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，成熟神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞的功能等都具有重要的調(diào)節(jié)作用。在免疫系統(tǒng)中，Notch信號(hào)通路參與T細(xì)胞、B細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的功能調(diào)控。值得注意的是，Notch

9、信號(hào)通路可以調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的極化，其過(guò)度活化可以導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量增多，從而引起促炎性因子的大量釋放。
　　缺氧性損傷是多種神經(jīng)疾病及神經(jīng)損傷的共同病理特征。發(fā)育中的大腦對(duì)低氧尤為敏感，多種原因可能導(dǎo)致胎兒及新生兒的大腦發(fā)生缺氧性損傷。若缺氧發(fā)生在早產(chǎn)兒，易導(dǎo)致腦室周圍白質(zhì)病變(Periventricular damage，PWMD)，嚴(yán)重者可發(fā)生腦室周圍白質(zhì)軟化(Periventricular Leukomalacia，

10、PLV)，從而導(dǎo)致胎兒及新生兒死亡或神經(jīng)發(fā)育異常。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在這一病理改變中發(fā)揮重要作用。本課題利用新生大鼠低氧性腦損傷的動(dòng)物模型，及小膠質(zhì)細(xì)胞激活的體外模型，探討Notch信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞激活過(guò)程中的作用，并分析其作用機(jī)制。首先，檢測(cè)新生大鼠低氧性腦損傷后Notch信號(hào)通路在腦內(nèi)的表達(dá)，明確其是否在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)及損傷后表達(dá)量的變化，并利用原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞及BV-2細(xì)胞系明確Notch信號(hào)通路的表達(dá)、激活

11、及對(duì)炎癥相關(guān)因子等釋放的影響。其次，利用經(jīng)典的脂多糖刺激誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，觀察Notch信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖以及遷移的影響及其機(jī)制。最后，我們對(duì)Notch信號(hào)通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制進(jìn)行研究。具體的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　第一部分，低氧環(huán)境下Notch信號(hào)通路在新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及作用。免疫熒光結(jié)果顯示，在低氧性腦損傷的新生大鼠中，胼胝體區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的受體Notch-1，配體Delta-1以

12、及Notch-1蛋白活化后形成的活性片段NICD表達(dá)增強(qiáng)。其次，在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，利用qPCR及免疫熒光針對(duì)Notch-1、Delta-1、NICD，以及NICD在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合的分子RBP-Jκ、下游基因Hes-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)低氧處理后，Notch-1、Delta-1、NICD、RBP-Jκ及Hes-1的表達(dá)均增高，說(shuō)明低氧處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的表達(dá)和激活顯著增強(qiáng)。應(yīng)用γ-分泌

13、酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)通路，經(jīng)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)阻斷Notch信號(hào)通路后多種炎癥相關(guān)因子的mRNA水平顯著降低。再次，在低氧處理的BV-2細(xì)胞系中檢測(cè)Notch信號(hào)通路的表達(dá)及功能。利用qPCR和Western blot對(duì)上述Notch信號(hào)通路中的分子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中Notch-1、Delta-1表達(dá)明顯增高，NICD、RBP-Jκ、及下游基因Hes-1表達(dá)均增多。應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notc

14、h信號(hào)通路，Western blot結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎性因子的釋放顯著降低，且Griess法檢測(cè)證實(shí)一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放量明顯降低。NF-κB信號(hào)通路是小膠質(zhì)細(xì)胞中介導(dǎo)炎性因子釋放的最主要的信號(hào)通路，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路阻斷后可以抑制BV-2細(xì)胞以及低氧損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活。
　　第二部分，Notch信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及遷移的影響。我們利用經(jīng)典的脂多糖刺激誘導(dǎo)

15、小膠質(zhì)細(xì)胞活化，觀察Notch信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖以及遷移的影響。首先BrdU摻入實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示Notch信號(hào)通路阻斷后小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)較激活BV-2細(xì)胞明顯降低，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(cyclindependent kinase inhibitors，CDKI) p27kip1的mRNA及蛋白水平均顯著增高。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Notc

16、h信號(hào)通路關(guān)鍵基因RBP-Jκ和Hes-1均可以結(jié)合在p27kip1的啟動(dòng)子區(qū)域，作為負(fù)轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控p27kip1的表達(dá)。
　　第三部分,Notch信號(hào)通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子機(jī)制。對(duì)Notch信號(hào)通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的具體分子機(jī)制進(jìn)行探討。首先，Western blot結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路阻斷后NF-κB，MAPKs中的p38，JNK(c-Jun N-terminal kinase)等多個(gè)通路的激活均受到顯著抑

17、制。其次，這些通路激活途徑中的共同分子TAK1的活化明顯降低。K63位特異性泛素化抗體進(jìn)行western blot檢測(cè)，顯示TAK1位置處泛素化水平明顯降低。再次，通過(guò)qPCR，Western blot以及免疫染色等發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路阻斷后，去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白(Cylindromatosis，CYLD)的mRNA及蛋白水平顯著提高。最后利用染色質(zhì)免疫共沉淀進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Hes-1作為負(fù)轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合在CYLD的啟動(dòng)子區(qū)