小續(xù)命湯有效成分組藥物代謝動力學(xué)研究及蛋白質(zhì)組學(xué)初探.pdf

1、中藥復(fù)方“小續(xù)命湯”最早見于漢魏兩晉時期著名醫(yī)家陳延之的《小品方》，方由:防風(fēng)、附子、生姜、杏仁、麻黃、人參、桂枝、芍藥、川芎、防己、黃芩、甘草12味中藥組成。該方具有“溫經(jīng)通陽，扶正驅(qū)風(fēng)”的功能，主要用于治療中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥。小續(xù)命湯具有良好的臨床療效和長期應(yīng)用的歷史，是中藥復(fù)方中極具代表性的方劑之一。近年來研究顯示，小續(xù)命湯不僅對中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥具有明顯的治療作用，對阿爾茨海默病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、頑固性高血壓等其他疾病也具有一定

2、療效。隨著近現(xiàn)代科技對中藥及中藥復(fù)方的不斷深入研究，為了能夠在理論上更好的闡述中藥復(fù)方治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用模式，中藥復(fù)方有效成分組的理念應(yīng)運而生。中藥復(fù)方中的有效成分是中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)，既不是簡單的活性部位，也不是無序的有效部位群，而是能夠體現(xiàn)中醫(yī)藥組方理論的有效成分的有機組合，是一個完整的有效成分組合，稱為有效成分組。本課題以能夠反應(yīng)經(jīng)典復(fù)方“小續(xù)命湯”療效的有效成分組——小續(xù)命湯有效成分組為研究對象，通過對其物質(zhì)基礎(chǔ)、

3、血漿中多成分方法學(xué)的建立、藥物代謝動力學(xué)研究及蛋白質(zhì)組學(xué)初探，對小續(xù)命湯在物質(zhì)基礎(chǔ)及生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供了有效的參考依據(jù)。
　　為了闡述該復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，本課題通過UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，從小續(xù)命湯有效成分組中鑒定了42個化合物，主要包括黃酮類、生物堿類、三萜皂苷類成分，并歸屬了各化合物的單味中藥來源。在物質(zhì)基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，針對小續(xù)命湯有效成分組中37種化合物建立了大鼠血漿中LC-MS/MS檢測方法，對該方法

4、進行了血漿中專屬性、準確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)等方法學(xué)驗證。本方法具有靈敏度高、準確性好、重復(fù)性強、響應(yīng)值高等優(yōu)點。而后利用該檢測方法測定了大鼠血漿中漢黃芩素、千層紙素A苷、漢黃芩苷、甘草素、千層紙素A、黃芩苷等11種小續(xù)命湯成分的濃度，描述其藥物代謝動力學(xué)特征、并計算藥代參數(shù)。在物質(zhì)基礎(chǔ)及藥物代謝研究的基礎(chǔ)上，為了進一步探討其生物學(xué)基礎(chǔ)及小續(xù)命湯可能存在的靶點和生物體調(diào)控通路，本課題應(yīng)用UPLC-Q-Exactive技術(shù)的蛋

5、白質(zhì)組學(xué)法探索小續(xù)命湯有效成分組對大鼠局灶性腦缺血作用的生物學(xué)基礎(chǔ)，尋找相關(guān)蛋白靶點及其涉及的生物體調(diào)控通路，為小續(xù)命湯有效成分組對治療局灶性腦缺血的生物學(xué)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。
　　1.對近年來國內(nèi)外文獻進行查閱，梳理匯總中藥復(fù)方小續(xù)命湯的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理作用及臨床應(yīng)用情況。小續(xù)命湯在唐宋時期曾為治風(fēng)之首劑，被古時醫(yī)家尊為治療中風(fēng)的要劑，該方含有十二味中藥，組方相對復(fù)雜，且其物質(zhì)基礎(chǔ)研究及藥效機制研究尚不深入。通過篩選、分析小續(xù)命湯物

6、質(zhì)成分基礎(chǔ)，探討其在體內(nèi)復(fù)雜變化，以及對小續(xù)命湯的藥理效應(yīng)和臨床應(yīng)用進行闡述。旨為對小續(xù)命湯這一中藥復(fù)方提供更為深入、全面的認識，并對實驗的后續(xù)工作提供依據(jù)和參考。
　　2.為了快速闡明中藥復(fù)方小續(xù)命湯的化學(xué)組成，利用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MS)對小續(xù)命湯有效成分組進行了快速分析和成分鑒定。液相條件:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)

7、色譜柱，以0.1％甲酸水-乙腈為流動相進行梯度洗脫，柱溫40℃，流速0.35mL·min-1;質(zhì)譜條件:采用ESI源，正、負離子模式下分別進行數(shù)據(jù)采集。通過與對照品信息的提取辨識、與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的匹配指認以及對文獻資料的比照分析，從小續(xù)命湯有效成分組中鑒定了42個化合物，主要包括黃酮類、生物堿類、三萜皂苷類成分，并歸屬了各化合物的單味中藥來源。本研究比較全面地闡明了小續(xù)命湯有效成分組的化學(xué)組成，為此中藥復(fù)方的質(zhì)量控制提供參考，也為其深入的

8、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.建立了小續(xù)命湯有效成分組中37個化合物血漿中LC-MS/MS檢測方法，并對該方法進行了血漿中專屬性、準確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)等方法學(xué)驗證。選用Agilent Poroshell120SB-C18色譜柱(2.1×100mm，2.7μm)，乙腈和0.1％甲酸-水作為流動相，梯度洗脫，流速為0.35mL·min-1，進樣量為10μL。采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為多反應(yīng)

9、離子監(jiān)測(MRM)。本實驗LC-MS/MS測定方法具有靈敏度高、準確性好、重復(fù)性強、響應(yīng)值高等優(yōu)點。血漿中37種化合物的的線性范圍適用于檢測，提取回收率穩(wěn)定，基質(zhì)效應(yīng)符合相關(guān)要求。本方法符合生物樣品檢測要求，適用于血漿中藥物濃度的測定并進行藥代動力學(xué)研究。
　　4.經(jīng)HPLC-MS/MS測定，小續(xù)命湯有效成分組黃酮類成分含量分別為漢黃芩素0.31％、千層紙素A苷0.69％、漢黃芩苷0.93％、甘草素0.04％、千層紙素A0.17％

10、、黃芩苷0.17％、黃芩素0.98％、異甘草苷0.15％，麻黃堿0.45％、升麻素0.12％、5-O甲基阿米醇苷0.31％。利用HPLC-MS/MS測定大鼠灌胃小續(xù)命湯有效成分組后，血漿中漢黃芩素、千層紙素A苷、漢黃芩苷、甘草素、千層紙素A、黃芩苷、黃芩素、異甘草苷、麻黃堿、升麻素、5-O甲基阿米醇苷的濃度，采用WinNonLin軟件非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)。從藥時曲線可知，大鼠體內(nèi)的漢黃芩苷、千層紙素A苷、千層紙素A、黃芩苷與異甘

11、草苷均存在明顯的雙峰現(xiàn)象，這與文獻的報道基本一致，并推測這些成分在體內(nèi)是由于肝腸循環(huán)或苷與苷元之間的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，而這些化合物的雙峰現(xiàn)象無疑會增加和維持各成分在體內(nèi)較高的血藥濃度，進而有助于小續(xù)命湯有效成分組發(fā)揮療效。
　　5.應(yīng)用UPLC-Q-Exactive技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)法探索小續(xù)命湯有效成分組對大鼠局灶性腦缺血作用的生物學(xué)基礎(chǔ)，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血(MCAO)模型，運用UPLC-Q-Exactive納升液相

12、-質(zhì)譜聯(lián)用檢測系統(tǒng)分析空白組、缺血模型組、小續(xù)命湯組大鼠右側(cè)大腦皮層全蛋白。Mascot和Proteome Discoverer軟件進行蛋白質(zhì)鑒定及相對定量分析?？瞻讓φ战M和MCAO模型組比較獲得789個差異蛋白，MCAO模型組和小續(xù)命湯組比較獲得702個差異蛋白，通過生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白主要可歸為參與細胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、細胞組分組成與合成、免疫系統(tǒng)過程。以上相關(guān)蛋白靶點及其涉及的生物體調(diào)控通路可能是小續(xù)