NASH中自噬通過TRAF6介導(dǎo)的泛素化抑制Kupffer細胞NLRP3炎癥小體激活機制的研究.pdf

1、第一部分：NLRP3炎癥小體和自噬在NASH患者和小鼠肝臟中的表達
　　目的：收集非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）患者肝組織標本，建立NASH小鼠模型，觀察NLRP3炎癥小體和自噬在NASH患者和小鼠肝臟中表達和激活水平的變化。
　　方法：（1）術(shù)中收集NASH患者的肝組織標本和肝臟相對正?；颊吒闻K標本，蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin stai

2、ning，HE)及油紅染色并通過NAFLD活動度評分標準將患者分為Ctrl組和NASH組，比較兩組患者血清甘油三酯、游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）和白細胞介素-1β（imerleukin-1β，IL-1β）的水平以及 NLRP3炎癥小體和自噬相關(guān)蛋白的表達水平。（2）用 HFD喂養(yǎng)小鼠建立 NASH小鼠模型，并給予短期饑餓處理，HE染色及油紅染色觀察肝組織病理變化，透射電鏡觀察自噬小體激活情況，Western Bl

3、ot(WB)檢測小鼠肝臟及Kupffer細胞（KCs）中NLRP3炎癥小體和自噬相關(guān)蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：（1）HE染色和電鏡可見 NASH患者肝細胞有大量脂滴聚集，呈氣球樣變，NASH患者肝臟的 P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平較正常肝組織有明顯升高（P＜0.01）；LC3I向 LC3II的轉(zhuǎn)化水平以及 Beclin-1表達水平較正常組降低（P＜0.05）。（2）HE染色和油紅染色見NASH小鼠肝

4、臟脂滴大量聚集，炎癥細胞浸潤；WB顯示NASH小鼠肝臟的P62、NLRP3、ASC和 caspase-1蛋白表達水平較正常肝組織有明顯升高（P＜0.01）；電鏡和WB提示NASH小鼠肝臟自噬水平下降。WB結(jié)果提示短期饑餓組自噬相關(guān)蛋白表達較HFD組恢復(fù)，NLRP3炎癥小體激活減少。NASH患者和NASH小鼠血清IL-1β表達水平顯著增加（P＜0.01）。
　　結(jié)論：NASH患者和NASH小鼠肝臟的NLRP3炎癥小體蛋白較正常肝臟表

5、達升高，自噬相關(guān)蛋白表達水平下降。NASH患者和NASH小鼠血清 IL-1β表達水平增加。NASH小鼠經(jīng)短期饑餓處理后自噬功能有所恢復(fù)，NLRP3炎癥小體激活有所減少。
　　第二部分：激活自噬對Kupffer細胞中NLRP3炎癥小體激活的影響
　　目的：探討在棕櫚酸（Palmitic acid，PA）刺激下的KCs中，不同激活水平的自噬對NLRP3炎癥小體激活和IL-1β分泌的影響。
　　方法：分離培養(yǎng)KCs隨機分為6

6、組： Ctrl組，普通培養(yǎng)基；DMSO組，含DMSO培養(yǎng)基；PA組，0.5mM PA刺激12h；PA+雷帕霉素組（PA+R），50μM雷帕霉素預(yù)刺激4h后0.5mM PA刺激12h；PA+渥曼青霉素組（PA+W），50μM渥曼青霉素預(yù)刺激4h后0.5mM PA刺激12h；PA+饑餓組（PA+STAR），不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)4h后0.5mM PA刺激12h。收集細胞及上清液，電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)及自噬小體形成情況，WB

7、與qPCR檢測LC3、P62、Beclin-1、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白和相關(guān)基因的表達，ELISA檢測細胞上清液IL-1β水平。
　　結(jié)果：（1）透射電鏡可見PA組 KCs胞質(zhì)中有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成。PA+W組細胞中脂滴體積較大，自噬小體較少。PA+R組細胞中自噬小體增多，脂滴體積較小。（2）mRFP-EGFP-LC3雙熒光標細胞顯示PA組自噬流增加；PA+R組自噬流增強；PA+W組明顯減弱。（3）WB結(jié)

8、果顯示，PA組LC3II/LC3I和Beclin-1的表達都較Ctrl組有明顯增加（P＜0.01）；P62，NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與Ctrl組相比也有顯著升高（P＜0.01）。PA+W組LC3II/LC3I和 Beclin-1的表達較 PA組明顯減弱（P＜0.01）； NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較顯著增加（P＜0.01），P62的表達比PA組增加也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。P

9、A+R組LC3II/LC3I和Beclin-1的表達與PA組沒有明顯差異（P＞0.05）； P62、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較顯著下降（P＜0.01），NLRP3的表達與PA組比較也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。（4）qPCR結(jié)果顯示，PA組 ATG5、ATG7和Beclin-1的mRNA表達都較Ctrl組有明顯增加（P＜0.01）；P62，NLRP3、ASC和caspase-1表達與Ctrl組相比也有顯著升高（P

10、＜0.01）。PA+W組ATG5、ATG7和Beclin-1的表達較PA組減弱（P＜0.05）； P62、NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表達與PA組比較增加（P＜0.05）。PA+R組 ATG5、ATG7和 Beclin-1的表達與 PA比較明顯增加（P＞0.05）； P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較下降。（5）ELISA結(jié)果示：PA組IL-1β水平較Ctrl組升高（P＜0.01）。

11、PA+W組IL-1β水平較PA組明顯升高（P＜0.01）；PA+R組IL-1β水平較PA組顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：PA刺激KCs使 NLRP3炎癥小體和自噬激活增加。用雷帕霉素激活自噬，可以抑制NLRP3炎癥小體的激活，以及IL-1β的分泌。相反，用渥曼青霉素抑制自噬，則促進NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β分泌。
　　第三部分：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor rece

12、ptor-associated factor6，TRAF6）通過泛素化介導(dǎo)自噬對NLRP3炎癥小體激活的調(diào)控
　　目的：探討PA刺激下自噬和NLRP3炎癥小體互相作用機制，以及TRAF6在其中的作用。
　　方法：激光共聚焦顯微鏡觀察NASH患者和NASH小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白和炎癥小體相關(guān)蛋白的共定位；免疫共沉淀檢測PA刺激前后ASC蛋白與LC3、Beclin-1、P62的互相作用關(guān)系；WB檢測PA刺激前后ASC泛素化水平；構(gòu)

13、建載有TRAF6-shRNA的慢病毒質(zhì)粒沉默TRAF6，用免疫共沉淀和WB檢測沉默TRAF6后ASC泛素化水平的變化。
　　結(jié)果：激光共聚焦顯微鏡觀察在NASH患者和NASH小鼠肝臟存在自噬和炎癥小體共定位；免疫共沉淀結(jié)果顯示PA刺激后ASC蛋白與LC3、Beclin-1、P62形成共聚體的量較刺激前增加；WB檢測結(jié)果表明，PA刺激后ASC總泛素化、K63泛素化和K48泛素化水平都增強；慢病毒沉默TRAF6后發(fā)現(xiàn)ASC總泛素化、K