四種觀賞植物植原體病害的分子檢測與鑒定.pdf

1、植原體是一類無細胞壁的原核生物，屬于原核生物界（Procaiyotae）柔膜菌綱（Mollicutes），專性寄生于植物韌皮部的篩管細胞中，主要靠吸食植物韌皮部汁液的葉蟬、飛虱等昆蟲介體傳播。由于植原體難以在無細胞介質(zhì)中進行人工培養(yǎng)，不能依靠傳統(tǒng)上用于微生物分類的表型特征進行鑒定，故其分類便不可避免地依靠分子生物學手段。目前國際上植原體的分類主要依靠其高度保守的16S rRNA基因，尤其是Lee等基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增16S r

2、DNA序列并進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析構(gòu)建了第一個全面的植原體分類方案，為植原體分類提供了可靠方法。經(jīng)過定期的更新和修訂，這個以16S rDNA的PCR-RFLP分析為基礎(chǔ)的分類系統(tǒng)已被廣泛接受并用于對植原體菌株進行分類。
　　本研究利用分子生物學手段和電子顯微鏡技術(shù)對4種疑似植原體病害的病原種類進行了分子檢測與鑒定。在山東青島發(fā)現(xiàn)了疑似植原體侵染的表現(xiàn)黃化癥狀的牡丹（Paeonia suffruticosais）植

3、株，在透射電子顯微鏡下觀察到感病牡丹的韌皮部篩管細胞中存在典型的植原體。然后使用通用引物P1/P7（直接PCR引物）以及R16F2n/R16R2（巢式PCR引物）克隆其16S rRNA基因?qū)υ撝苍w進行分子鑒定，并對其進行序列分析、系統(tǒng)進化分析以及RFLP分析，結(jié)果表明，引起牡丹黃化病的病原為植原體(Tree peonyyellows phytoplasma，簡稱TPY)，能夠劃分到暫定種‘Candidatus.phytoplasma

4、solani’，且該植原體屬于16SrⅫ組（stolbur組），并且代表16SrⅫ組的一個新亞組(16SrⅫ-H)。之后我們克隆了該植原體的核糖體蛋白（rp）基因以及延伸因子（tuf)基因，序列分析以及系統(tǒng)進化分析結(jié)果與16S rRNA基因的分析結(jié)果一致，進一步證實了該植原體的分類地位。這是世界范圍內(nèi)關(guān)于植原體感染牡丹的首次報道。從山東泰安采集到表現(xiàn)黃化癥狀的烏桕（Sapium sebiferum）枝條及葉片樣品，在透射電子顯微鏡下觀察

5、到感病烏桕的韌皮部篩管細胞中存在植原體。之后以表現(xiàn)黃化癥狀的烏桕韌皮部總DNA為模板使用通用直接引物P1/P7以及巢式引物R16F2n/R16R2進行巢式PCR擴增其16S rRNA基因片段，并使用rp基因引物rpL2F3/rp(Ⅰ)R1A以及rp(Ⅲ)-FN/rp(Ⅰ)R1A進行半巢式PCR擴增其rp基因。基于16S rRNA基因以及rp基因進行序列分析以及系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明與烏桕黃化病相關(guān)的病原為植原體，且屬于16SrⅢ組（Ⅹ-

6、病組）。然后我們利用pDRAW32軟件以及iphyClassifier在線軟件對其16SrRNA基因F2n/R2區(qū)段進行模擬RFLP分析，發(fā)現(xiàn)CTTY的RFLP圖譜與現(xiàn)存的16SrⅢ組的各亞組成員均不一致，且相似系數(shù)≦0.97。之后經(jīng)過實際的RFLP驗證，結(jié)果與虛擬分析的結(jié)果一致，因此烏桕黃化植原體（Chinese tallow treeyellows phytoplasma,將其簡稱CTTY）代表16SrⅢ組中的一個新亞組(16SrⅢ

7、-Y)。本研究在世界范圍內(nèi)首次確定烏桕為16SrⅢ組植原體的新寄主。
　　本研究在山東泰安發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)黃化癥狀的茶花（Camellia japonica）植株。透射電鏡觀察結(jié)果顯示感病的茶花植株韌皮部篩管細胞中存在植原體。通過使用植原體通用引物P1/P7以及R16F2n/R16R2進行巢式PCR擴增其16S rRNA基因片段，并且對16S rRNA基因F2n/R2區(qū)段進行RFLP分析，結(jié)果顯示引起茶花黃化病的病原為植原體，屬于榆樹黃

8、化組(16SrⅤ)，并且能夠劃分到16SrⅤ-B。對其rp基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，其rp基因序列與rpⅤ-C亞組的一致率最高。因此，茶花黃化植原體(Camelliayellowsphytoplasma，將其簡稱CY)，為16SrⅤ-B（rpⅤ-C）亞組成員，這是世界范圍內(nèi)關(guān)于植原體感染茶花的首次報道。疑似植原體侵染的表現(xiàn)黃化癥狀的三角梅（Bougainvillea sp.）植株在山東泰安被發(fā)現(xiàn)。利用植原體16S rRNA基因通用引物P1/P

9、7以及R16F2n/R16R2從表現(xiàn)黃化癥狀的三角梅總DNA中擴增得到了1244bp的特異性片段。序列分析結(jié)果表明，三角梅黃化植原體(paper floweryellows phytoplasma，簡稱PFY)屬于16SrⅫ組(stolbur組，暫定種‘Ca.phytoplasma solani’)。RFLP分析結(jié)果表明PFY的RFLP圖譜與16SrⅫ-A亞組植原體一致，證明引起三角梅黃化病的植原體屬于16SrⅫ-A亞組。并且通過對該植