氧化脅迫對(duì)球孢白僵菌生理及代謝影響的研究.pdf

1、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是被廣泛研究和應(yīng)用的昆蟲病原真菌之一，然而在實(shí)際應(yīng)用中，殺蟲效果受各種脅迫因素的制約，其中活性氧自由基造成的損傷對(duì)真菌侵染效果有顯著影響。為了抵抗氧化脅迫逆境，昆蟲病原真菌具有生物體中普遍存在的超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutlthione perolidlse, GPX）等抗氧化酶

2、以及具有自由基清除活性的小分子代謝物，組成一個(gè)完整的抗氧化系統(tǒng)對(duì)氧化脅迫作出應(yīng)激響應(yīng)，共同抵抗活性氧自由基的損傷。
　　本論文以球孢白僵菌為研究對(duì)象，利用不同類型的自由基試劑氧的化脅迫作用，在不同方面和層次上考察了氧化脅迫對(duì)球孢白僵菌菌株的生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)的影響；綜合研究了在脅迫狀態(tài)下相關(guān)抗氧化酶活性和轉(zhuǎn)錄水平上的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程；基于代謝組學(xué)分析方法，研究了在H2O2脅迫處理下的球孢白僵菌菌絲體代謝物差異。從細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、抗氧化酶

3、活性的變化上，以及酶蛋白合成的轉(zhuǎn)錄水平差異和代謝物的調(diào)整等多方面，對(duì)氧化應(yīng)激所表現(xiàn)出的多種生物學(xué)效應(yīng)和相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了探討。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　以SOD酶活性為指標(biāo)和清除DPPH自由基能力為指標(biāo)，對(duì)不同來(lái)源的球孢白僵菌菌株進(jìn)行了抗氧化能力評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示不同菌株總SOD酶活水平差異顯著，對(duì)DPPH清除能力大小不等，清除效率存在顯著差異。
　　以球孢白僵菌Bb202為研究對(duì)象，利用兩種類型的自由基試劑H2O2及

4、亞硝基二磺酸鉀（K2NO(SO3)2），考察了在不同濃度活性氧自由基脅迫下，對(duì)球孢白僵菌菌株生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞的生理生化指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在脅迫處理后12h，不同濃度的H2O2和K2NO(SO3)2都不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，濃度為1mmol/L和2mmol/L的 H2O2對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較小，但能夠促進(jìn)胞內(nèi)SOD酶活性的提高。較高濃度的H2O2脅迫對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響顯著，并且胞內(nèi)SOD酶活性有較大下降。在低濃度的K2NO(SO3)2脅

5、迫下，菌株生物量與對(duì)照相比差異不顯著，但SOD酶活性變化較為顯著，SOD酶活明顯高于對(duì)照。較高濃度的K2NO(SO3)2同樣抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和酶活力。
　　顯微觀察分析表明，不同濃度H2O2脅迫處理下，菌絲體細(xì)胞均有損傷，形態(tài)差異顯著，高濃度的H2O2會(huì)造成菌絲提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)濃度下的K2NO(SO3)2脅迫對(duì)菌絲細(xì)胞的影響相對(duì)溫和，損傷效應(yīng)相比H2O2時(shí)間滯后，菌體受損的程度低于H2O2的脅迫。
　　外源性和內(nèi)源性的

6、活性氧脅迫下，球孢白僵菌細(xì)胞三種抗氧化酶活性有較大的差異，并且對(duì)于氧化脅迫的應(yīng)激響應(yīng)程度也不同。在外源性的H2O2脅迫下，能迅速引起胞內(nèi)CAT的酶活性的升高（脅迫12h），相對(duì)酶活與對(duì)照相比提高了136.5％，差異顯著。同樣也刺激了GPX酶活性的升高，其酶活在脅迫處理24h時(shí)達(dá)到最高，相對(duì)酶活為對(duì)照組的112%，SOD活性雖然在脅迫處理24 h時(shí)達(dá)到最大，但在開(kāi)始時(shí)較低（脅迫1h），只有對(duì)照組的81.9%。K2NO(SO3)地較為強(qiáng)烈地

7、促進(jìn)了三種抗氧化酶活性的升高，細(xì)胞響應(yīng)比較迅速，在脅迫處理后12h時(shí)，SOD酶活為對(duì)照組的123.8%，CAT和GPX分別為對(duì)照的125.9%和126.4%，但GPX所表現(xiàn)的應(yīng)急響應(yīng)程度高于CAT，而CAT酶活是伴隨著胞內(nèi)SOD活性升高的，二者酶活升高的時(shí)間基本保持同步。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究表明，H2O2和K2NO(SO3)2脅迫對(duì)三種抗氧化酶mRNA表達(dá)量均有顯著影響，對(duì)于外源H2O2的脅迫，CAT mRNA的轉(zhuǎn)錄水

8、平表現(xiàn)的最為積極，脅迫后1h和12h時(shí)，mRNA轉(zhuǎn)錄水平相比同時(shí)段的對(duì)照組上調(diào)了1.57和3.72倍；SOD和GPX的響應(yīng)程度稍低于CAT，H2O2脅迫后1h時(shí)，Cu/Zn-SOD和GPX的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化不大，在脅迫后12h時(shí)Cu/Zn-SOD和GPX的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比同時(shí)段對(duì)照組上調(diào)了5.4倍和2.88倍。在K2NO(SO3)2脅迫處理下，Cu/Zn-SOD、GPX和CAT轉(zhuǎn)錄水平均能迅速上調(diào)，在脅迫1h時(shí)，mRNA轉(zhuǎn)錄水平

9、分別為同時(shí)段的對(duì)照1.49倍、2.8倍和2.41倍在脅迫處理12h時(shí)的Cu/Zn-SOD和CAT mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，相比同時(shí)段的對(duì)照組上調(diào)了2.5倍和2.4倍。
　　H2O2脅迫處理下，不同培養(yǎng)時(shí)間的球孢白僵菌菌絲體醇提取物，DPPH和羥基自由基清除率都有明顯差異，在脅迫12h-36h時(shí)間范圍內(nèi)，其菌絲體提取物對(duì)羥基自由基清除率均顯著高于對(duì)照組，而對(duì)DPPH抑制率只在脅迫處理后36h時(shí)顯著高于對(duì)照，為49.6%。表明外源自由基脅

10、迫可激發(fā)內(nèi)源抗氧化或清除自由基的代謝物產(chǎn)生。不同時(shí)間段的菌絲體GSH含量變化較大，但普遍低于對(duì)照組。K2NO(SO3)2造成的脅迫引起球孢白僵菌絲體中GSH含量的增加。在H2O2脅迫后1h至24h，球孢白僵菌絲體中MDA含量均高于同時(shí)間對(duì)照組，其中在12h時(shí)，其含量與對(duì)照相比具有顯著性差異。H2O2脅迫對(duì)球孢白僵菌絲體生物膜有較大損傷，膜損傷可能是白僵菌在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中活力下降的重要原因之一。VC/FeSO4模型和NADH模型體系都能引

11、起球孢白僵菌線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化，一定濃度范圍的谷胱甘肽具有較好的抗線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化作用。
　　應(yīng)用高分辨液質(zhì)聯(lián)用并結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法，分析了在H2O2脅迫處理下的球孢白僵菌菌絲體代謝物變化。通過(guò)PLS-DA的分析結(jié)果表明，氧化脅迫明顯影響了球孢白僵菌的代謝，多變量分析和聚類分析結(jié)果顯示，在氧化脅迫處理下，球孢白僵菌菌絲體代謝物與正常生長(zhǎng)的菌株存在顯著差異，通過(guò)譜庫(kù)檢索等方法分別準(zhǔn)確定性了43種差異代謝物。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)