布拉氏酵母菌對幽門螺桿菌感染BALB-c小鼠Th17-Th1細胞的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察抗生素及益生菌在幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠IFN-γ及IL-17活性及對機體Th17/Th1平衡的影響，探索益生菌對幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠的保護機制。
　　 方法：
　　 復活凍存幽門螺桿菌菌株于培養(yǎng)基中微需氧、37℃條件下培養(yǎng)72小時，取菌落行革蘭氏染色及Giemsa染色，經光鏡下觀察、觸酶、氧化酶及尿素酶測試后判定是否為幽門螺桿菌生長。選用清潔級6周齡BALB/c小鼠50只（由中

2、國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供），雌雄各半，體質量（20±1g），隨機分成實驗組44只（新鮮HP菌懸液灌胃，1×109CFU/mL，0.5mL/只），對照組6只（生理鹽水灌胃，0.5ml/只），1次/日，連續(xù)7天。所有小鼠平時不限制飲食及飲水，實驗組灌胃前8小時予禁食，灌胃后禁食4小時。隨機取材證實造模成功后予實驗組三聯(lián)抗生素、益生菌及聯(lián)合用藥干預，藥物濃度分別為克拉霉素50mg/mL，奧美拉唑1mg/mL，阿莫西林75 mg/

3、mL，布拉氏酵母菌50mg/mL。每天給藥1次，共2周，末次治療后4周時禁食24h小鼠后腹腔注射10％水合氯醛麻醉，剖腹后腹主動脈采血及無菌取出全胃。采血后離心收集上清用于ELISA檢測，胃組織用4％多聚甲醛固定12～16 h留取組織標本，進行常規(guī)HE染色，光學顯微鏡觀察組織大體改變，Giemsa染色觀察幽門螺桿菌定植情況。
　　 免疫組化染色及結果判定方法:采用免疫組化二步法檢測模型組、抗生素組、益生菌組及聯(lián)合用藥組中IFN-

4、γ及IL-17的表達。IFN-γ兔抗鼠一抗購自北京博奧森生物有限公司，工作濃度:1∶300。IL-17兔抗鼠一抗購自北京博奧森生物有限公司，工作濃度:1∶200。鼠抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。用PBS代替一抗做陰性對照。結果判定:IFN-γ和IL-17在細胞漿或細胞膜中呈現清晰棕黃色特異性免疫反應顆粒為陽性細胞。每組取6張組化染色片（陽性者表現為胞質或胞核棕黃色顆粒），在每張切片上隨機選取5個視野照相，采

5、用人工計數法分析免疫組化陽性得分。
　　 ELISA測定及結果判定方法:采血使用不含熱原和內毒素的試管，室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清用于ELISA檢測。應用雙抗體夾心法，依次進行標準品的稀釋和加樣、待測樣本加樣、37℃溫育、洗滌、加辣根過氧化物酶、37℃溫育、洗滌、顯色、終止液終止顯色、加終止液后15min內在450nm波長處依次測定各孔的吸光度（OD值），并繪制標準

6、曲線，由曲線方程計算各樣本濃度值，再乘以稀釋倍數。應用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗水準α=0.05，P＜0.05即認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 復活凍存幽門螺桿菌菌株于培養(yǎng)基中微需氧、37℃條件下培養(yǎng)72小時可見菌落呈灰白色半透明狀，取少許菌落，經革蘭氏及Giemsa染色后可鑒定為幽門螺桿菌生長。灌胃及用藥后表現:幽門螺桿菌造模組灌胃期間出現進食水差，腹瀉，皮毛蓬松無光澤，體重下降，活動少

7、，抖動，走路不穩(wěn)，對外界聲音刺激反應能力明顯下降。灌胃結束1周后體重恢復緩慢，藥物干預后，抗生素組、益生菌組及聯(lián)合用藥組小鼠活動量增加，皮毛恢復光澤，腹瀉好轉，進食恢復正常，癥狀、體征逐漸消失，體重增長良好。
　　 病理改變:HE染色后光鏡下幽門螺桿菌造模組有不同程度的炎癥表現如淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤等改變，干預治療后炎癥性細胞浸潤減少，黏膜完整連續(xù)。
　　 免疫組化:模型組小鼠胃黏膜可見大量棕黃色IFN-γ及IL-

8、17顆粒沉積于細胞漿或細胞膜，表達強于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？股亟M及益生菌組呈陽性或弱陽性表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。聯(lián)合治療組呈弱陽性或陰性表達，明顯弱于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。空白對照組表達強弱不等，考慮與應激等因素有關。
　　 ELISA測定IFN-γ及IL-17表達:模型組IFN-γ，IL-17表達顯著高于其余各組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義?？股亟M及益生菌

9、表達量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。聯(lián)合治療組表達量顯著低于其余各組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義?？瞻讓φ战M表達偏高，考慮與應激等因素有關。
　　 結論：
　　 IFN-γ及IL-17在幽門螺桿菌感染小鼠中陽性表達率較高，提示二者可能協(xié)同參加了HP誘導的機體炎癥反應，并造成黏膜炎癥損傷，與疾病的嚴重程度密切相關。經聯(lián)抗生素及益生菌干預后，Th1主要代表者IFN-γ及Th17代表者IL-17明顯降低(P＜0.05

10、)，差異有統(tǒng)計學意義，提示藥物干預可以降低機體內Th17/Th1反應，減少體內炎癥反應，促進炎癥恢復?？股馗深A及益生菌干預后IFN-γ及IL-17相比較P均＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，提示本實驗中益生菌治療可能與抗生素干預無明顯差異，可能與益生菌抑制HP的黏附、分泌某些抗細菌黏附的活性物質并與HP競爭黏附于胃黏膜結合位點有關。聯(lián)合用藥組IFN-γ及Th17明顯降低，提示聯(lián)合應用抗生素及益生菌治療可能對機體清除幽門螺桿菌、減輕炎癥反應