小麥葉片衰老基因TaLS--2D的圖位克隆.pdf

1、衰老是作物的重要農(nóng)藝性狀，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。適宜的衰老能夠有效地提高作物的產(chǎn)量并且能夠增強(qiáng)作物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。因此，挖掘衰老相關(guān)基因并對(duì)其功能進(jìn)行解析，不僅能增加對(duì)小麥衰老調(diào)控機(jī)制的理解和認(rèn)識(shí)，還能為小麥新品種的選育提供新的基因資源。
　　小麥衰老突變體m68是從優(yōu)異小麥品種偃展4110(YZ4110)EMS突變體庫(kù)中篩選出來(lái)的，突變體的葉片衰老啟動(dòng)比野生型早。為了克隆控制m68衰老基因，將野生型偃展4110(YZ4110)和

2、多樣性親本內(nèi)鄉(xiāng)188(NX188)分別與衰老突變體m68雜交。培育了YZ4110x m68BC2F2∶3共計(jì)763個(gè)株系、NX188x m68F2∶3共計(jì)10133個(gè)株系，遺傳分析表明m68的衰老性狀是由一對(duì)隱性基因控制的。利用713對(duì)SSR分子標(biāo)記篩選與作圖結(jié)果表明該基因位于小麥2DL染色體上，在標(biāo)記Xcfd116和Xgwm157之間，小麥660K SNP芯片分析結(jié)果也表明該基因位于2DL上，這是一個(gè)新的控制小麥衰老的基因，命名為Ta

3、LS-2D。利用比較基因組學(xué)，粗山羊草和小麥參考基因組序列信息，開發(fā)了1109對(duì)新的SSR分子標(biāo)記和46對(duì)KASP標(biāo)記，最終將基因TaLS-2D定位于分子標(biāo)記M270和M1065之間，并與KASP標(biāo)記S3共分離。分子標(biāo)記M270和M1065各能檢測(cè)到一個(gè)重組單株。候選基因區(qū)段對(duì)應(yīng)粗山羊草和小麥的參考基因組上的物理距離大約是3Mb，短柄草、水稻和高粱的物理區(qū)段分別是93.8Kb，116Kb和107Kb。
　　利用TriAnnot網(wǎng)站

4、對(duì)矮抗58、中國(guó)春和粗山羊草參考基因組序列對(duì)候選基因所在區(qū)段進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，分別預(yù)測(cè)到19，20和23個(gè)基因。結(jié)合YZ4110和m68葉片不同衰老時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，在候選基因區(qū)段內(nèi)有3個(gè)與衰老進(jìn)程相關(guān)的基因，其中g(shù)ene2和gene4的表達(dá)量隨著衰老的進(jìn)程表達(dá)量逐漸升高，gene6的表達(dá)量隨著衰老的進(jìn)程表達(dá)量逐漸降低。雖然gene2的編碼區(qū)在野生型和突變體中存在SNP，即C＞T的突變，但是通過(guò)對(duì)重組單株和BC2F2∶3中衰老表型

5、單株的測(cè)序表明該突變與目標(biāo)性狀不是共分離的，所以gene2不是候選基因。然后對(duì)候選區(qū)段內(nèi)的其他基因進(jìn)行測(cè)序與分析，結(jié)果表明只有g(shù)ene13的第一個(gè)外顯子在野生型和突變體中存在SNP，即C＞T，該SNP導(dǎo)致了氨基酸改變，對(duì)重組單株和BC2F23回交后代測(cè)序驗(yàn)證表明該突變與衰老性狀共分離，所以將gene13作為候選基因進(jìn)行下一步的研究。
　　對(duì)野生型和m68突變體四個(gè)不同衰老時(shí)期的旗葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析表明S1，S2，S3和S4時(shí)期分別

6、有2396，8383，13355和16130個(gè)差異表達(dá)基因，其中在S1，S2，S3和S4時(shí)期下調(diào)表達(dá)的基因分別有366，3142，6452和8761個(gè)，上調(diào)表達(dá)的基因分別有2030，5241，6903和7369個(gè);GO富集分析表明下調(diào)和上調(diào)表達(dá)基因分別富集在141和143個(gè)GO條目上，其中，WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子、激酶相關(guān)基因參與啟動(dòng)突變體葉片的衰老，衰老影響葉片的生理代謝如葉綠素代謝，光合作用以及糖代謝等。KEGG pathway分析