葛根異黃酮的分離純化和葛藤的初步研究.pdf

1、葛根(Raix Puerariae)是一種傳統(tǒng)中藥，含有多種有效成分，其中以葛根素、大豆苷和大豆苷元等異黃酮類成分為主。葛根素可用于治療心血管疾病、心絞痛和心率失常等疾病，大豆苷和大豆苷元可用于治療和預(yù)防婦女疾病。目前對葛根異黃酮的分析和分離純化，主要針對葛根素，降低了葛根自身的利用價值。此外，目前我國野葛(Puerariae Lobata(wild)Ohwi)的研究和開發(fā)都集中在葛根與葛花部位，而對葛藤部位的分析主要為異黃酮類成分，對

2、其它有效成分的分析以及生物活性的研究少。
　　 為進一步研究和開發(fā)茅山地區(qū)的野葛資源，本文以茅山地區(qū)的葛根和葛藤為研究對象，研究葛根異黃酮的分析方法、分離純化工藝和葛藤的化學(xué)成分分析及抗氧化活性，為葛根產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和茅山野葛的全面開發(fā)和綜合利用提供基礎(chǔ)。
　　 目前對江蘇茅山地區(qū)的野葛中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的同時測定研究未見報道，2005版藥典中關(guān)于葛根中測定葛根素的前處理是否適用于葛根中葛根素、大豆苷和大

3、豆苷元的同時測定有待研究。因此，本文研究同時測定野葛中葛根素、大豆苷和大豆苷元的前處理和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分析方法。樣品前處理采用70％乙醇50℃超聲提取20min，RP-HPLC直接測定，并與藥典方法進行對比。對照品葛根素、大豆苷和大豆苷元分別在0.2140～1.2840，0.0178～0.1066和0.0044～0.0026μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9998，0.9997和0.9994，平均回收

4、率分別為99.46％，104.29％和111.54％，RSD分別為2.20％，4.60％和6.60％(n=5)。精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。超聲提取法測得的葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為3.98％，0.36％和0.039％，高于藥典提取法測得的這3種化合物含量，更適于同時提取葛根素、大豆苷和大豆苷元。葛莖中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為40mg/kg，32mg/kg和6.6mg/kg，葛葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別

5、為16mg/kg，50mg/kg和12mg/kg。該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡單，分離效果好，可用于野葛的根、莖和葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的同時測定；江蘇茅山地區(qū)野葛莖和葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量大大低于葛根中的含量。
　　 目前關(guān)于葛根異黃酮的大孔樹脂純化方法的報道很多，但主要都是對葛根素進行純化。本文重點研究一種能同時從葛根中獲取多種有效成分葛根素、大豆苷和大豆苷元的大孔樹脂純化法。通過靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸試驗考察A

6、B-8、D-101、NKA和D1300四種大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的吸附量和解析率，優(yōu)選出AB-8樹脂為最佳樹脂，并且考察和優(yōu)化AB-8分離純化葛根總黃酮的工藝條件。結(jié)果表明，AB-8樹脂對葛根總黃酮的吸附效果較好，吸附量達116.33 mg/g；Langmuir方程能較好的描述其吸附等溫線；AB-8樹脂分離純化葛根總黃酮工藝的適宜條件為進樣質(zhì)量濃度9.63g/L，流速1.5 mL/min，用蒸餾水洗脫多糖雜質(zhì)后，采用10％，30％，5

7、0％，70％乙醇依次梯度洗脫，分部收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，可得到不同活性成分的純化物。10％乙醇洗脫可得到以葛根素為主要活性成分的純化物，含量為87.17％；30％乙醇洗脫可得到以葛根素和大豆苷為主要活性成分的純化物，葛根素和大豆苷含量分別為53.72％和18.4.1％；50％乙醇和70％乙醇洗脫得到以大豆苷元為主的洗脫液，大豆苷元含量分別為72.41％和74.31％。因此梯度洗脫可獲得不同活性成分的精制異黃酮。
　　

8、茅山地區(qū)葛藤中異黃酮成分葛根素、大豆苷和大豆苷元含量很低，為進一步研究葛藤中是否含有其他活性成分，本文對茅山地區(qū)野葛藤的不同提取部位進行了初步研究。采用水蒸氣蒸餾-乙醚萃取法、醇提法和水提醇沉法對野葛藤進行提取，得到揮發(fā)油、醇提物和粗多糖三種不同提取部位，并對其成分進行初步分析。
　　 采用硫酸催化甲酯化衍生化方法對葛藤揮發(fā)油進行氣相質(zhì)譜(GC-MS)分析，結(jié)果表明，葛藤分離出的153個組分中可鑒定組分70個，其中醇類化合物(9

9、個)占總量的7.44％；酮類化合物(2個)占4.41％；烯烴類化合物(3個)占0.65％；烷烴類化合物(5個)占0.76％；醛類化合物(7個)占0.43％；烷酸類化合物(22個占53.23％；烯酸類化合物(11個)占18.45％；芳烴類化合物(4個)占0.65％；酯類化合物(4個)占3.55％；酚類化合物(1個)占0.25％；其他化合物(1個)占1.35％。
　　 采用2種分光光度法對野葛藤醇提物的總黃酮含量進行測定。結(jié)果表明，

10、以蘆丁為對照品的UV測定方法測得的總黃酮含量為5.66％，以葛根素為對照品的UV測定方法測得的總黃酮含量為1.95％。對水提醇沉得到的粗多糖含量進行測定，葛藤粗多糖的得率為8.39％，粗多糖中多糖含量為30.31％，可見茅山地區(qū)的葛藤含有較為豐富的多糖類物質(zhì)。
　　 用DPPH法、鄰二氮菲法和鄰苯三酚自氧化法研究了葛藤揮發(fā)油、醇提物和粗多糖清除自由基活性。結(jié)果表明，葛藤醇提物、粗多糖和揮發(fā)油都具有良好的清除自由基活性，且清除效果

11、都是粗多糖最強，醇提物次之，揮發(fā)油的抗氧化活性最弱。對于DPPH·，揮發(fā)油、醇提物和粗多糖的IC50值分別為3.3011、1.0767和0.1229mg/mL(Vc的IC50值為0.0091.mg/mL)；對于·OH，揮發(fā)油、醇提物和粗多糖的IC50值分別為3.0755、1.5615和0.7511mg/mL(Vc的IC50值為0.3477mg/mL)。；對于O2-·，揮發(fā)油、醇提物和粗多糖的IC50值分別為2.3424、1.1460和0