人巨細(xì)胞病毒潛伏激活的臨床診斷相關(guān)研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒基因組龐大并且復(fù)雜,而且其潛伏激活的相關(guān)機(jī)制又涉及到病毒與宿主雙方因素,其基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢。為此,HCMV活動(dòng)性感染的臨床診斷相關(guān)研究也受到極大的阻礙。
　　 在深入該研究之前,必須對中國人群(即后續(xù)研究對象)的感染背景有一個(gè)明確的了解。為此,我們收集了瑞金醫(yī)院8190份血清標(biāo)本并檢測HCMV特異性抗體IgG。然后以年齡分層,計(jì)算各年齡組的血清陽性率。接著以此作為變量利用催化模型計(jì)算感染率的三個(gè)衍生參數(shù):感染力,再次

2、感染率和平均感染年齡,進(jìn)一步評估人群的感染狀況及嚴(yán)峻程度。結(jié)果顯示,上海地區(qū)人群(>1歲)HCMV加權(quán)感染率為95.40％。最小年齡組(>1-3歲)的血清陽性率為最低,但已達(dá)60.37％。在之后近20年中,CMV血清陽性率隨年齡快速上升。至>20-25歲年齡組,此時(shí)血清陽性率達(dá)到了97.03％。整個(gè)人群的HCMV感染力為8.04/100位易感人群/年,這一數(shù)值大大高于發(fā)達(dá)國家人群的相應(yīng)參數(shù)值。基于此數(shù)據(jù)計(jì)算所得的再次感染率為5.78,而

3、平均感染年齡為7.87歲(后者是根據(jù)25歲前群體的感染力數(shù)值計(jì)算的)。以25歲為分界線,低于25歲年齡段人群的感染力(12.69)明顯高于25歲之后的年齡段人群(～8.00)。
　　 盡管目前HCMV活動(dòng)性感染的診斷方法層出不窮,但是并沒有一個(gè)公認(rèn)的最佳方法(爭議不斷),臨床醫(yī)師的選擇也非?；靵y。況且中國人群(上海地區(qū)人群是中國人群的典型代表)與國外人群(尤其是西方發(fā)達(dá)國家)的感染率差異如此之大,那么基于對方人群所推薦的HCMV

4、活動(dòng)性感染檢測手段(倘若有的話)是否適用于我國人群?為了解決這一問題,我們根據(jù)當(dāng)前所有檢測手段的方法類型的差異以及所檢測的血液成分的差異,從中選出4種最有代表性的HCMV活動(dòng)性感染監(jiān)測手段,并利用HCMV復(fù)制程度不同的兩個(gè)群體,對它們之間復(fù)雜的相互關(guān)系進(jìn)行了深入的探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不論在哪個(gè)群體中,血漿和白細(xì)胞HCMV DNA定量PCR這兩種方法檢測結(jié)果的一致性總是最高的。在免疫力正常的群體中,血漿與細(xì)胞定量PCR雙陽性標(biāo)本占前者陽性標(biāo)本

5、的59.09％,占后者陽性標(biāo)本的20.31％。該兩方法對免疫力正常群體的所有檢測值間的Pearson相關(guān)系數(shù)雖僅為0.3056(p=0.0001),但在所有方法的兩兩相關(guān)分析中為最高。在免疫低下的HSCT病人中,所檢測到的絕大部分HCMV激活期都呈現(xiàn)為白細(xì)胞HCMV DNA實(shí)時(shí)定量PCR的敏感性高于或等同于血漿定量PCR方法(22/26,84.62％)。至于pp65抗原血癥與細(xì)胞定量PCR,兩者在免疫力正常群體中檢測結(jié)果吻合度較弱(表現(xiàn)

6、為雙陽性標(biāo)本只占前者陽性標(biāo)本的26.47％,占后者陽性標(biāo)本的14.06％；而且兩方法所有檢測值間的Pearson相關(guān)系數(shù)也只有0.1024,p=0.0245)。而在免疫低下的HSCT病人中,兩者間一致性有所提升,但是仍然有近一半的激活期表現(xiàn)為pp65抗原血癥敏感性高于細(xì)胞定量PCR(17.65％,3/17),或者兩方法所得的陽性結(jié)果不落在相同的激活期(23.53％.4/17)。因此,我們可以認(rèn)為白細(xì)胞HCMV DNA定量PCR有充足的理

7、由取代血漿定量PCR在臨床的應(yīng)用。但是pp65抗原血癥與細(xì)胞定量PCR之間則沒有這種一方可被另一方取代的趨勢和證據(jù),卻有互補(bǔ)的特性。也就是說,將該兩種方法在臨床上聯(lián)合應(yīng)用其價(jià)值應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于任何單一方法。
　　 HCMV活動(dòng)性感染檢測的目的是為了搶先治療(pre-emptive therapy),若常規(guī)的治療方案(ACV或GCV)效果不佳時(shí),我們必須考慮到病毒株的耐藥。因此HCMV潛伏激活的臨床診斷廣義上也包括耐藥診斷。前期的研究

8、已經(jīng)明確,我國人群HCMV感染率極高,株型復(fù)雜,多重感染幾率高,耐藥篩選更加便捷和頻繁；況且國內(nèi)外醫(yī)療系統(tǒng)針對HCMV激活感染的用藥方案(包括劑量,療程和用藥時(shí)機(jī)等)也存在很大差異,因此中國人群的HCMV耐藥可能有其自身的特點(diǎn)。而UL97是最主要的GCV耐藥相關(guān)基因,國外對其耐藥譜研究已經(jīng)基本完整,但我國才剛開始。在前期的大規(guī)模篩選中,我們發(fā)現(xiàn)了UL97基因許多非同義新突變型。為了減少實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的工作量,我們采用計(jì)算機(jī)手段對UL97野生型

9、蛋白部分氨基酸序列(329-572aa)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬,以此為基礎(chǔ)分析突變所引起的結(jié)構(gòu)信息改變,并給出耐藥提示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),最終篩選出的模擬結(jié)構(gòu)是以1YDTE為模板,以L1.FASTA為比對文件所得的Model A。整個(gè)分子的能量最低,ProQ的預(yù)測分?jǐn)?shù)最高。分子對接分析也發(fā)現(xiàn)了潛在的.ATP和GCV結(jié)合口袋。利用已知的陰陽性耐藥點(diǎn)突變也證實(shí)了該結(jié)構(gòu)的合理性。同時(shí)根據(jù)突變前后結(jié)構(gòu)信息的改變,提示C518Y以及聯(lián)合突變(E517G和C51

10、8Y)呈現(xiàn)高度可疑的耐藥特性。
　　 在前期大規(guī)模的UL-97基因擴(kuò)增和測序中,我們發(fā)現(xiàn):盡管該基因較為保守,但是其同義突變遠(yuǎn)比非同義突變來得頻繁。按照傳統(tǒng)思維,這種不引起氨基酸改變的突變是沒有意義的。但是隨著研究的深入,越來越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)同義突變可以多種方式最終影響蛋白的功能。況且UL97基因是HCMV繁殖極為重要的基因,其多態(tài)性是否真如預(yù)想中的那樣隨機(jī)與毫無意義呢?為此,我們收集了來自三個(gè)不同病人群體的68條UL97基因序

11、列,并構(gòu)建了進(jìn)化樹,結(jié)合病人臨床資料結(jié)果發(fā)現(xiàn):68條序列在進(jìn)化樹圖譜中主要分為兩個(gè)群或簇(Cluster1 and2),Cluster1序列主要來自于兒科病人群體,而Cluster1主要來自于HSCT病人群體。但是腎移植病人的13條序列幾乎是均等地分布在Cluster1和Cluster2中,而這兩部分序列所對應(yīng)的病人群體最大的區(qū)別是中位移植天數(shù)的差異(358 days in cluster1 vs74 days in cluster2)