AAPH誘導(dǎo)小鼠早期胚胎氧化應(yīng)激的分子機(jī)制及谷胱甘肽抗氧化作用的研究.pdf

1、近幾年隨著技術(shù)水平的不斷提高，體外受精技術(shù)被廣泛應(yīng)用于優(yōu)良性狀家畜胚胎的規(guī)模化生產(chǎn)、人類不孕不育的治療等方面。盡管研究者對(duì)于培養(yǎng)液的改良、培養(yǎng)條件的優(yōu)化做了大量的工作，由于不能完全模擬體內(nèi)的受精環(huán)境，因此體外培養(yǎng)條件仍難達(dá)到與體內(nèi)相當(dāng)?shù)呐咛グl(fā)育率。研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是影響胚胎體外發(fā)育的重要因素，但對(duì)于活性氧影響胚胎質(zhì)量的分子機(jī)理仍知之甚少。本研究就活性氧誘導(dǎo)劑AAPH誘導(dǎo)小鼠早期胚

2、胎氧化應(yīng)激的分子機(jī)制及抗氧化劑谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的恢復(fù)作用進(jìn)行了研究。
　　一、AAPH對(duì)小鼠早期胚胎的影響及其分子機(jī)制
　　1、采用濃度為0.1、1.0、1.5、2.0mM的AAPH分別處理受精卵和2-細(xì)胞胚胎。結(jié)果表明，1.5mM AAPH處理受精卵24h后，全部胚胎發(fā)生2-細(xì)胞阻滯，在48h后出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象。處理2-細(xì)胞24h后，也全部停滯在2-細(xì)胞期。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇處理?xiàng)l件為1.5mM、

3、處理時(shí)間24h的受精卵作為研究對(duì)象。利用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行ROS檢測(cè)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)活性氧相關(guān)基因（Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表達(dá)。結(jié)果顯示，處理組的活性氧水平顯著升高(P＜0.05)，并且Gpx6、Prdx2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而Gpx4的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。表明氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。
　　2、JC-1染色、凋亡及其相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，處理組2-細(xì)胞胚胎的線粒體膜電位顯著降

4、低(P＜0.05)，凋亡相關(guān)基因（Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9）的表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)，并檢測(cè)到早期凋亡信號(hào)。合子基因組激活相關(guān)基因（Zscan4d、eIF-1A、Hspa1b、H2afz）的表達(dá)量均極顯著降低(P＜0.01)。
　　二、GSH對(duì)AAPH處理后的早期胚胎發(fā)育的恢復(fù)及其作用機(jī)制
　　1、在1.5mM AAPH處理?xiàng)l件下，同時(shí)分別加入1、2、3mM的GSH分別處理受精卵和

5、2-細(xì)胞胚胎。處理受精卵24h后，各濃度的GSH均不能使2-細(xì)胞胚胎突破阻滯，但能夠顯著提高第一次卵裂率。其中，2mM GSH處理后第一次卵裂率最高。處理2-細(xì)胞24h后，胚胎有部分能夠突破2-細(xì)胞阻滯但均不能發(fā)育到囊胚階段。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇處理?xiàng)l件為2mM GSH+1.5mM AAPH、處理時(shí)間24h的受精卵作為研究對(duì)象。DCFH-DA染色及活性氧相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，活性氧水平仍顯著升高(P＜0.05)。
　　2、

6、加入GSH后，線粒體膜電位顯著升高(P＜0.05)，并且未檢測(cè)到早期凋亡信號(hào)以及合子基因組激活相關(guān)基因表達(dá)的恢復(fù)。
　　3、低濃度AAPH(0.5mM)處理受精卵后，只有8％的受精卵能發(fā)育到4-細(xì)胞，加入GSH后有23.7％能夠發(fā)育到4-細(xì)胞，顯著降低了胚胎的阻滯率(P＜0.05)，提高了胚胎的發(fā)育率，但胚胎仍不能發(fā)育到囊胚階段。
　　綜上所述，較高濃度的AAPH會(huì)引起活性氧水平的升高，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而引起線粒體膜電位