FGFR2在骨骼發(fā)育與骨形成中的作用與機制研究.pdf

1、為了研究自噬和顱縫MSCs衰老在Apert綜合征發(fā)病中的作用，我們基于Cre-Loxp系統(tǒng)建立了Apert小鼠和敲除p16基因的Apert小鼠，綜合應用骨骼組織病理和原代細胞培養(yǎng)等對比觀察Apert小鼠和p16敲除Apert小鼠頭顱畸形、顱縫早閉、衰老表型及顱縫MSCs的自噬、衰老情況，并深入研究FGFR2對自噬和衰老的調(diào)控作用，以及自噬和干細胞衰老在Apert發(fā)生中的作用。
　　在第二部分實驗中，我們建立了成年期可誘導增強FGF

2、R2-P253R的小鼠，通過BMX模型，研究FGFR2功能增強對骨形成和骨重塑的影響，并探討相關(guān)機制。
　　在第三部分實驗中，我們研究了一種新的FGFR1特異性抑制劑G141，對由FGF-2或IL-1β引起的人類關(guān)節(jié)軟骨細胞或組織塊關(guān)節(jié)退變中的作用和對小鼠因內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定(DMM)導致的關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。
　　方法：
　　第一部分:FGFR2在Apert綜合征發(fā)病中的作用與機制研究
　　1.建立Apert小鼠

3、模型，測量小鼠的體重和體長，利用X線攝片、Micro-CT觀察小鼠大體表型和骨骼變化，通過H&E染色觀察Apert小鼠皮膚表型，通過western blot觀察小鼠肝、腎和骨組織中p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平變化:
　　2.利用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色觀察顱縫MSCs衰老陽性細胞數(shù)，利用標記保留細胞(Label Retaining Cells)方法，通過EdU長時程標記觀察顱縫MSCs細胞數(shù)目，利用TUNEL染色觀

4、察顱縫MSCs凋亡情況，分離Apert小鼠顱縫MSCs，觀察其克隆形成能力、增殖能力、衰老狀態(tài)及p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平表達變化;
　　3.建立p16-/-;Fgfr2P253R/+雙突變小鼠模型，通過X線攝片和阿爾新藍茜素紅全骨架染色觀察，小鼠大體表型變化，通話HE染色觀察顱縫早閉情況:
　　4.建立可反映Apert小鼠自噬狀態(tài)的GFP-LC3;Apert小鼠，組織切片觀察顱縫MSCs自噬變化;分離小鼠顱

5、縫間充質(zhì)細胞，Western blot觀察LC3水平變化;
　　第二部分:FGFR2在BMX后骨形成中的作用與機制研究
　　1.建立成年期可誘導增強FGFR2小鼠，制作BMX模型;
　　2.通過Micro-CT和硬組織切片von kossa染色定量觀察BMX后1周、2周和3周股骨和脛骨骨髓腔中骨形成情況;
　　3.利用H&E染色和組織形態(tài)計量統(tǒng)計BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨細胞數(shù)目變化，同時利用定量P

6、CR檢測BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColⅠ、Alp、OP和OC的mRNA水平變化;
　　4.利用TRAP染色和組織形態(tài)計量觀察BMX后1周、2周和3周新生骨組織中破骨細胞表面積變化，同時利用定量PCR檢測BMX后1周、2周和3周新生骨組織Rankl、Opg、M-Csf及Rankl/Opg的比值變化;
　　5.利用EdU標記觀察BMX后4天間充質(zhì)細胞和BMX后1周成骨細胞增殖情況，采用免疫

7、組化觀察BMX后一周Runx2和OC的表達水平變化;
　　第三部分:一種新的FGFR1抑制劑對關(guān)節(jié)炎的治療作用研究
　　1.采用激酶抑制實驗檢測G141對FGFR1、VEGFR2、PDGFRβ、FGFR2和FGFR3的抑制作用，確定其半抑制濃度(IC50)，采用caliper mobility shift assay檢測G141與ATP的競爭性關(guān)系;
　　2.分離人類原代關(guān)節(jié)軟骨細胞，采用FGF-2和G141處理后，通

8、過westemblot檢測MMP13和ADAMTS5的蛋白表達變化，通過定量PCR檢測Mmp13、Adamts5、TypeⅡcollagen和Aggrecan的mRNA表達水平變化;
　　3.采用IL-1β和G141處理人類原代關(guān)節(jié)軟骨細胞后，通過定量PCR檢測Mmp13、Adamts5、TypeⅡcollagen和Aggrecan的mRNA表達水平變化，通過western blot檢測MMP13和JNK、ERK1/2和p38 M

9、APK信號通路變化;
　　4.體外培養(yǎng)人類股骨頭軟骨組織塊，加入FGF-2和或G141共培養(yǎng)14天，蔵紅固綠染色檢測軟骨基質(zhì)丟失情況，DMMB試驗檢測GAG釋放情況;
　　結(jié)果:
　　第一部分:FGFR2功能增強突變通過降低自噬引起干細胞衰老導致Apert綜合征的發(fā)生
　　1.Apert小鼠表現(xiàn)為早衰表型:身長體重減少，骨質(zhì)疏松，皮膚變薄，腎臟組織中衰老相關(guān)β-gal陽性細胞增加，DNA損傷識別因子γH2AX及周

10、期蛋白依賴性激酶抑制物p53、p16和p21表達升高;
　　2.Apert小鼠顱縫間充質(zhì)干細胞衰老、減少:顱縫間充質(zhì)中EdU長時程標記細胞減少，β-gal陽性細胞增多，顱縫間充質(zhì)細胞增殖減慢，凋亡增加，克隆形成能力降低;
　　3.X線攝片結(jié)果顯示Apert;p16+/-小鼠其身長較Apert小鼠明顯增加，頭顱圓鈍表型明顯緩解。阿爾新藍-茜素紅全骨架染色顯示Apert;p16+/-小鼠其頭顱較Apert小鼠變長，冠狀縫重疊明顯

11、緩解，同時顱底變長，顱底軟骨連接早閉現(xiàn)象較Apert小鼠稍有緩解;
　　4.與LC3-GFP小鼠相比，Apert;LC3-GFP小鼠其顱縫間充質(zhì)細胞中LC3聚集明顯減少;Apert小鼠顱縫間充質(zhì)細胞中LC3水平明顯降低;
　　第二部分:FGFR2功能增強突變小鼠BMX后骨形成增加，骨吸收過程延遲和骨吸收減少，Wnt/β-catenin信號通路可能參與了這個過程
　　1.Micro-CT和von kossa染色顯示FGF

12、R2功能增強突變小鼠BMX后1周、2周和3周骨髓腔中骨形成增加;
　　2.H&E染色和組織形態(tài)計量結(jié)果顯示FGFR2功能增強突變小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨細胞數(shù)目增加，定量PCR結(jié)果顯示FGFR2功能增強突變小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨分化相關(guān)基因Runx2、Alp、ColⅠ、Opn和Ocn mRNA表達水平升高;
　　3.TRAP染色和和組織形態(tài)計量結(jié)果顯示野生小鼠破骨細胞表面積在BMX后

13、1周達到高峰，隨著骨組織逐漸吸收，破骨細胞表面積在2周和3周逐漸減少。而在FGFR2功能增強突變小鼠BMX后1周破骨細胞活性較低，在BMX后2周達到高峰，而在BMX后第3周又明顯較野生小鼠降低。FGFR2功能增強突變小鼠BMX后2周破骨細胞吸收高峰較野生突變小鼠BMX后1W破骨細胞吸收高峰明顯降低;
　　4.EdU染色顯示BMX后4天FGFR2功能增強突變小鼠骨髓腔中間充質(zhì)細胞增殖明顯加快和BMX后7天FGFR2功能增強突變小鼠新

14、生骨組織中成骨細胞增殖明顯加快，免疫組化結(jié)果顯示BMX后7天FGFR2功能增強突變小鼠新生骨組織中Runx2和OC陽性成骨細胞明顯增加;定量PCR結(jié)果顯示FGFR2功能增強突變小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨組織中Rankl、Opg mRNA水平明顯升高，而Rankl/Opg比值在BMX1周降低，在BMX后2周升高;
　　第三部分:關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射FGFR1抑制劑G141可以延緩DMM誘導的小鼠關(guān)節(jié)軟骨退變
　　1.激酶活

15、性抑制實驗顯示G141對FGFR1有較高的結(jié)合力和抑制性，其半抑制濃度(IC50)為2.7±0.54μM，同時G141對FGFR1激酶活性的抑制不依賴于ATP濃度;
　　2.Western blot結(jié)果顯示G141處理可以明顯減少由FGF-2處理引起的p-ERK1/2、MMP-13和ADAMTS-5蛋白水平升高，定量PCR結(jié)果顯示G141處理可以明顯緩解FGF-2處理導致的Mmp-13、Adamts-5升高和TypeⅡcollag

16、en、Aggrecan降低;
　　3.Western blot結(jié)果顯示G141處理可以明顯減少由IL-1β處理引起的MMP13蛋白水平升高和JNK、ERK1/2和p38 MAPK信號通路的激活，定量PCR結(jié)果顯示G141處理可以明顯緩解IL-1β處理導致的Mmp-13、Adamts-5升高和TypeⅡcollagen、Aggrecan降低;
　　4.藏紅固綠染色顯示G141處理后能顯著緩解FGF-2處理導致的軟骨細胞外基質(zhì)丟

17、失，DMMB實驗結(jié)果顯示G141處理后能顯著緩解FGF-2處理導致的軟骨細胞外基質(zhì)GAG的釋放;
　　結(jié)論:
　　一、FGFR2功能增強突變通過降低自噬，導致線粒體功能障礙、ROS增加，引起顱縫MSCs衰老，導致Apert綜合征的發(fā)生，采用自噬激動劑雷帕霉素和抗氧化劑NAC處理Apert小鼠顱縫MSCs可以明顯緩解其衰老表型;
　　二、成年期小鼠FGFR2功能增強突變可通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路引起B(yǎng)M