多酚氧化酶的固定化及其對(duì)酚類化合物催化氧化性能研究.pdf

1、多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)是一類高效的酚類化合物氧化酶，在有氧條件下能催化單酚類化合物羥基化生成鄰苯二酚，又能氧化鄰苯二酚脫氫生成醌，最終醌類化合物自聚成不溶于水的高分子聚合物沉淀而被除去。殼聚糖是常用的酶固定化載體，其分子鏈上存在著大量的羥基、氨基，能夠與酶實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合。納米金粒子具有優(yōu)異的吸附性能、催化活性和生物相容性，已被成功地應(yīng)用于酶的傳感器的構(gòu)建，提高酶分子的催化性能。蒙脫土是一種層狀硅酸鹽，其

2、片層厚度及層間距處于納米尺度，比表面積大，具有很好的物理吸附性能。本文采用溶液插層法制備了殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物(c hitosan/montmorillo niteintercalation composites，CTS/MMT)和殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物(chitosan-nanogold/montmorillonite intercalation composites, CTS-Au/MMT)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。分別

3、以殼聚糖/蒙脫土和殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物為載體，采用吸附法和戊二醛交聯(lián)法固定多酚氧化酶，考察了固定化多酚氧化酶的最佳制備條件、多酚氧化酶的固定化方法以及固定化酶的性質(zhì)。選擇性能較優(yōu)的固定化酶對(duì)溶液中的苯酚、4-氯苯酚和2，4-二氯苯酚進(jìn)行催化氧化，考察了固定化酶對(duì)三種酚類化合物催化氧化的最佳條件，探討固定化酶對(duì)三種酚類化合物的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和重復(fù)使用性能，為酚類廢水的處理提供應(yīng)用依據(jù)。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
　

4、　(1)采用溶液插層法制備殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物，采用紅外光譜和X-射線衍射分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。并以此為載體，分別運(yùn)用吸附和戊二醛交聯(lián)兩種法固定多酚氧化酶，考察了戊二醛濃度、溶液pH值、酶與載體質(zhì)量比和固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活性和載酶量的影響，并以左旋多巴為底物考察了游離酶和固定化酶的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附法固定化多酚氧化酶(A-PPO)的活性更高，最佳制備條件為pH5.0，酶與載體質(zhì)量比20 mg/g，固定化時(shí)間6 h;固定化酶的

5、載酶量為12.12 mg/g，單位載體酶活為12.76×103 U/g，酶活回收率達(dá)81.7％。A-PPO和交聯(lián)法固定化多酚氧化酶(C-PPO)的最適酶促反應(yīng)條件為pH值8.0，溫度分別為40℃和30℃。與游離多酚氧化酶相比，固定化酶的操作穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性均有所提高。固定化酶重復(fù)使用5次后，可保留37.6％以上的相對(duì)酶活。PPO，A-PPO和C-PPO的米氏常數(shù)Km值分別為0.48，0.56和2.11mmol/L，較游離酶的Km值均有

6、所增加;最大反應(yīng)速率Vmax分別為2.70，2.08和2.48 U/g，較游離酶的Vmax值均有所減小。
　　(2)以殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物為載體，吸附法固定化多酚氧化酶，研究了固定化酶對(duì)苯酚、4-氯苯酚和2，4-二氯苯酚的催化氧化性能。結(jié)果表明，固定化酶對(duì)三種酚類化合物的最佳去除條件分別為:苯酚溶液pH值為7.0，溫度30℃;4-氯苯酚溶液pH值為5.0，溫度20℃;2，4-二氯苯酚溶液pH值為5.0，溫度30℃。固定化酶催化

7、三種酚類化合物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，固定化酶對(duì)2，4-二氯苯酚的親和力最大，催化反應(yīng)速度最快，Vmax/Km比值表明2，4-二氯苯酚為固定化多酚氧化酶的最適底物。固定化多酚氧化酶循環(huán)使用6次(24 h)后，對(duì)三種酚類化合物的去除率分別為15.7％、24.2％和27.8％。
　　(3)以殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物為還原劑，與氯金酸溶液反應(yīng)制備殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物，探討了該復(fù)合物的最佳制備條件，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。以此為載體，分

8、別采用吸附和戊二醛交聯(lián)法固定化多酚氧化酶，考察了固定化酶的最佳制備條件及其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物的最佳制備條件為氯金酸溶液濃度0.05mmol/L，氯金酸溶液pH為9.0，反應(yīng)時(shí)間4h，反應(yīng)溫度80℃。以CTS-Au/MMT為載體，最佳制備條件下吸附法固定化酶(A'-PPO)的酶活為24.02×103 U/g，載酶量為17.02 mg/g，與以CTS/MMT為載體相比，CTS-Au/MMT固定化多酚氧化酶的

9、酶活和載酶量明顯提高。
　　(4)以殼聚糖-納米金/蒙脫土插層復(fù)合物為載體，吸附法固定化多酚氧化酶，對(duì)苯酚、4-氯苯酚和2，4-二氯苯酚進(jìn)行催化氧化。結(jié)果表明，固定化酶對(duì)三種酚類化合物的最佳去除條件為苯酚溶液pH7.0，溫度30℃;4-氯苯酚溶液pH5.0，溫度20℃;2，4-二氯苯酚溶液pH值為5.0，溫度30℃。動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明固定化酶對(duì)苯酚的親和力最大，對(duì)4-氯苯酚的催化速度最快。三種底物的Vmax/Km比值4-氯苯酚最大，表