肺炎鏈球菌溶血素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡涉及p38MAPK信號(hào)通路的激活.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是臨床常見(jiàn)的能夠引起肺炎、腦膜炎、中耳炎和敗血癥的革蘭陽(yáng)性菌。在發(fā)展中國(guó)家肺炎鏈球菌性敗血癥致死占5歲以下兒童可預(yù)防性死亡的25％，每年導(dǎo)致120多萬(wàn)嬰兒死亡。肺炎鏈球菌的溶血素(Pneumolysin，PLY)在細(xì)菌致病和誘導(dǎo)宿主防御應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，但是目前對(duì)宿主防御肺炎鏈球菌溶血素的分子機(jī)制尚不十分清楚。
　　細(xì)菌入血后，血液中的免疫

2、細(xì)胞會(huì)與細(xì)菌及產(chǎn)物發(fā)生直接作用或者與感染組織分泌的信號(hào)分子發(fā)生間接的相互作用，從而引發(fā)宿主免疫防御。在這一過(guò)程中，單核細(xì)胞在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮了重要作用。但是目前關(guān)于單核細(xì)胞與PLY相互作用機(jī)制的研究少有報(bào)道，所以本文采用人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株(human acute monocyticleukemia cell line，THP-1)與PLY在體外共孵育的方式來(lái)初步探討單核細(xì)胞與PLY相互作用的機(jī)制，研究單核細(xì)胞凋亡情況及凋

3、亡通路信號(hào)分子的變化情況，為進(jìn)一步研究PLY觸發(fā)宿主瞬時(shí)和早期固有免疫
　　方法：
　　1.采用下述實(shí)驗(yàn)方法研究PLY對(duì)THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響：MTT法測(cè)定PLY對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖抑制情況；瑞氏染色觀察PLY對(duì)THP-1細(xì)胞形態(tài)的影響；透射電子顯微鏡觀察PLY誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞DNA片段化現(xiàn)象；同時(shí)將△A146 PLY(PLY的第146位氨基酸

4、發(fā)生缺失突變，無(wú)溶血活性)處理組作為陰性對(duì)照。
　　2.從以下幾方面初步探討PLY誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的免疫機(jī)制：分光光度法測(cè)定Caspase3，8，9活性；免疫細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-Xl及信號(hào)分子p38MAPK蛋白表達(dá)的變化；通過(guò)Western-Blot進(jìn)一步驗(yàn)證p38MAPK總蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平變化；p38MAPK抑制劑處理后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定THP-1細(xì)胞凋亡率變化情況；同時(shí)將△A146 PL

5、Y處理組作為陰性對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　1.將THP-1細(xì)胞分別與0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml PLY共同孵育24、48、72、96h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況，結(jié)果表明PLY對(duì)THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量和時(shí)間依賴性；0.05μg/ml和0.1μg/ml PLY分別處理THP-1細(xì)胞12 h后，通過(guò)瑞氏染色觀察到細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，透射電子顯微鏡觀察到THP-

6、1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且出現(xiàn)凋亡小體和核碎裂象等典型凋亡形態(tài)特征；0.05μg/ml PLY和0.1μg/ml PLY作用THP-1細(xì)胞6h后通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分別為13.15％和24.58％，作用12h后細(xì)胞凋亡率分別為17.09％和60.08％(P<0.05)；提取凋亡THP-1細(xì)胞DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)典型的凋亡“梯狀”條帶。
　　2.PLY與THP-1細(xì)胞共同孵育后，Caspase

7、3，8，9活性明顯升高；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平增高、抗凋亡蛋白Bcl-xl表達(dá)水平降低；Western-Blot顯示p38MAPK磷酸化水平增高；采用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，PLY誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡水平下降。
　　結(jié)論：
　　1.肺炎鏈球菌溶血素與THP-1細(xì)胞相互作用致THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　2.肺炎鏈球菌溶血素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體