CagA陽性幽門螺桿菌在促胃癌細胞干性特征增強中的作用及其機制研究.pdf

1、胃癌是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，全球胃癌的發(fā)病率和死亡率居高不下。據(jù)最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，我國胃癌的發(fā)病率和死亡率在所有腫瘤中均居第二位，每年死于胃癌的人數(shù)高達50萬。因此，研究影響胃癌發(fā)生發(fā)展的因素具有重要意義。
　　目前，世界范圍內(nèi)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylor)的感染率約50％，部分地區(qū)高達80％(Management of Helicobacter pylori infection-

2、the MaastrichtⅣ/FlorenceConsensus Report，2012)。在我國，H.pylori的感染率總體上也很高，成人中感染率達40-60％（第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告，2012），WHO早在1994年就已將其列為胃癌的Ⅰ類致癌因子。雖然H.pylori在人群中的感染率很高，但只有部分感染者最終發(fā)展為胃癌，究其原因，H.pylori的致病性與其菌株的種類、宿主遺傳因素及環(huán)境因素等有關(guān)。H.pylori

3、菌株類型的不同是導(dǎo)致不同臨床結(jié)局的重要原因。2012年歐洲馬斯特里赫特共識中提到，胃癌的發(fā)生發(fā)展受H.pylori毒力因子的影響，其循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)等級為1a。細胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA)編碼的CagA蛋白作為重要的毒力因子之一，其陽性菌株感染后導(dǎo)致嚴重臨床后果的危險性明顯大于陰性菌株，具有CagA基因的菌株是H.pylori中重要的致病菌株。CagA是由H.pylori的cag致

4、病島(cag pathogenicity island，cag PAI)上CagA基因編碼的蛋白，通過cag PAI編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)將CagA“注入”宿主細胞，是H.pylori唯一能進入宿主細胞而發(fā)揮生物學(xué)作用的蛋白。最新的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，CagA+ H.pylori菌株增加胃癌發(fā)生的風(fēng)險。CagA轉(zhuǎn)基因小鼠的胃癌發(fā)生率明顯增加，證實CagA是促進胃癌發(fā)生的關(guān)鍵分子。
　　腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC

5、s)學(xué)說認為腫瘤組織中存在一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有無限的自我更新和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的能力，是腫瘤產(chǎn)生的種子細胞，由于其同時具有高轉(zhuǎn)移潛能、對放化療等治療抵抗等特性，而被認為是惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。
　　以往有關(guān)H.pylori的研究主要集中于其在促進胃癌細胞增殖和抑制胃癌細胞凋亡中的作用。但最新的研究發(fā)現(xiàn)，CagA+ H.pylori可以通過誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal

6、transition，EMT），從而使胃癌細胞獲得胃癌干細胞特征。本課題進一步確認CagA+ H.pylori在促胃癌細胞干性特征增強中的作用，并闡明其機制。因此，本課題豐富了CagA+ H.pylori菌株感染的致病機理，有助于加深CagA+ H.pylori在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用的認識，為特異性根除CagA+ H.pylori提供新的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1、構(gòu)建H.pylori感染胃癌細胞模型，評價CagA+ H.

7、pylori對胃癌細胞干性特征的影響;
　　2、探討CagA+ H.pylori促胃癌細胞干性特征增強的分子機制。
　　方法：
　　1、評價CagA+ H.pylori對胃癌細胞干性特征的影響:
　　(1)構(gòu)建H.pylori感染胃癌細胞的模型;
　　(2)通過流式細胞技術(shù)，分別檢測CagA+ H.pylori（H.pylori菌株NCTC11637）感染組、CagA-H.pylori（以H.pylori菌

8、株NCTC11637為背景的CagA敲除株）感染組及未感染組中胃癌干細胞表面標志物陽性的胃癌細胞比例;
　　(3)通過PCR從mRNA水平進一步分析上述各組中胃癌干細胞表面標志物的轉(zhuǎn)錄水平;
　　(4)通過體外成球?qū)嶒炘u價上述各組中胃癌細胞的體外成球能力;
　　(5)通過免疫印記（Western blotting，WB）檢測上述各組中胃癌細胞干性轉(zhuǎn)錄因子的表達水平;
　　(6)光鏡下觀察上述各組中胃癌細胞形態(tài)學(xué)的

9、改變，WB檢測EMT標志物的表達變化。
　　2、探討CagA+ H.pylori促胃癌細胞干性特征增強的分子機制:
　　(1)通過免疫熒光實驗，在激光共聚焦下觀察β-catenin在上述各組胃癌細胞中的定位情況;
　　(2)通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測上述各組胃癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活化水平;
　　(3)通過WB檢測CagA+ H.pylori及CagA H.pylori感染胃癌細胞不同時

10、相點β-catenin核轉(zhuǎn)位關(guān)鍵磷酸化位點Ser675和Ser552的表達水平;
　　(4)使用c-met抑制劑SU11274及PI3K/Akt抑制劑GSK690693分別預(yù)處理胃癌細胞，通過WB進一步檢測CagA+ H.pylori感染后胃癌細胞中β-catenin的Ser675和Ser552位點磷酸化水平;
　　(5)使用Wnt/β-catenin抑制劑XAV預(yù)處理胃癌細胞，通過流式細胞技術(shù)、PCR以及成球?qū)嶒?，分別檢測

11、CagA+ H.pylori的感染對胃癌細胞中胃癌干細胞表面標志物陽性的胃癌細胞比例、胃癌干細胞表面標志物mRNA水平以及胃癌細胞成球能力的影響;
　　(6)使用Wnt/β-catenin抑制劑XAV預(yù)處理胃癌細胞，通過WB和PCR分別檢測CagA+ H.pylori的感染對胃癌細胞中干性轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Oct4蛋白表達水平及mRNA水平的影響;
　　(7)構(gòu)建Nanog和Oct4啟動子區(qū)域的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，通過雙熒

12、光素酶報告實驗檢測CagA+ H.pylori介導(dǎo)的β-catenin核轉(zhuǎn)位對Nanog和Oct4啟動子活性的影響;
　　(8)生物信息學(xué)預(yù)測β-catenin在Nanog和Oct4啟動子上的可能結(jié)合區(qū)域，通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)實驗檢測β-catenin作用于Nanog和Oct4啟動子的區(qū)域;
　　(9)通過C13尿素酶呼氣試驗及檢測血清中CagA抗體，將

13、胃癌患者分為CagA+H.pylori感染組及CagA-H.pylori感染組，分別檢測兩組患者胃癌組織標本中Nanog和Oct4蛋白表達水平及mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1、CagA+ H.pylori感染的胃癌細胞，與CagA-H.pylori感染組及未感染組相比，更多的胃癌細胞表現(xiàn)出胃癌干細胞樣特征;
　　2、CagA+ H.pylori活化Wnt/β-catenin信號通路，包括促進β-catenin的核轉(zhuǎn)

14、位及增強β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性;
　　3、CagA+ H.pylori通過c-met和/或Akt介導(dǎo)的通路促β-catenin C末端Ser675和Ser552位點的磷酸化，使β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位;
　　4、Wnt/β-catenin信號通路的活化是CagA+ H.pylori促胃癌細胞干性特征增強的重要環(huán)節(jié);
　　5、Wnt/β-catenin信號通路的活化參與CagA+ H.pylori上調(diào)干性轉(zhuǎn)錄因

15、子Nanog和Oct4;
　　6、CagA+ H.pylori感染的胃癌患者，與CagA-H.pylori感染的胃癌患者相比，胃癌組織標本中Nanog和Oct4的表達明顯增加。
　　結(jié)論:
　　CagA+ H.pylori通過活化Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)Nanog和Oct4的表達，促胃癌細胞干性特征增強。
　　意義：
　　目前，國內(nèi)外指南均推薦高風(fēng)險人群（慢性萎縮性胃炎、潰瘍、腸上皮化生、異

16、型增生及胃癌術(shù)后等）根除H.pylori的治療，但其分子機制并不清楚。本課題證實H.pylori中的高毒力致病菌株——CagA+ H.pylori可以促胃癌細胞干性特征增強，這可能是胃粘膜上皮細胞從異常增生到最終發(fā)展為胃癌的重要原因，也可能是胃癌根除術(shù)后少數(shù)殘余胃癌細胞致胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因。因此，本課題為深入理解和認識H.pylori感染的致病機制提供了新的視角，有助于加深CagA+ H.pylori在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用的認識，為特