微囊藻毒素-LR對(duì)HepG2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、微囊藻毒素(microcytstins,MCs)是由藍(lán)藻產(chǎn)生的且具有肝毒性的小肽內(nèi)毒素,可誘發(fā)肝炎并促發(fā)肝癌,對(duì)易感人群健康存在極大威脅。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究MCs對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2肝癌相關(guān)的原癌基因及抑癌基因表達(dá)的影響,探討該毒素誘導(dǎo)肝炎/肝癌的機(jī)理,為毒素暴露人群健康的防護(hù)提供理論支撐。
　　本研究采用常規(guī)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法,用純毒素MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行染毒處理,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,以確定該毒素的細(xì)胞毒性。根據(jù)細(xì)胞毒性

2、及其細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇MC-LR的非細(xì)胞毒染毒濃度為0nM、10nM、50nM、0.5μM、10μM、50μM、100μM;染毒時(shí)間分別為8h、24h、48 h和72 h。細(xì)胞染毒處理結(jié)束后,收集HepG2細(xì)胞、提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR;然后用qPCR檢測(cè)與肝癌相關(guān)的原癌基因c-Met、c-fos、c-jun、c-myc、N-ras及抑癌基因PTEN轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。同時(shí),采用Western blot方法檢測(cè)上述基因蛋白

3、水平的表達(dá)。本研究所獲得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果有如下3個(gè)方面。
　　1.MTT檢測(cè)結(jié)果和MC-LR的細(xì)胞毒性
　　用MC-LR處理HepG2細(xì)胞8h、24h時(shí),MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),染毒組和對(duì)照組之間對(duì)比發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。處理48 h時(shí)(除100μM組)染毒組細(xì)胞活性雖有所降低,但與對(duì)照組相比仍無(wú)明顯差別。僅100μM MC-LR暴露48 h后,細(xì)胞活力與對(duì)照組相比顯著下降。
　　2.MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞原癌基因及抑癌

4、基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
　　HepG2細(xì)胞經(jīng)MC-LR染毒處理后,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),原癌基因c-Met的相對(duì)表達(dá)量(mRNA水平)隨MC-LR處理劑量的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上升,且高濃度組較低濃度組上升更明顯。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因c-Met的表達(dá)。
　　原癌基因c-fos轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)MC-LR染毒8h時(shí)即明顯上調(diào),且均達(dá)到最高峰。染毒24 h、48 h和72 h時(shí),上調(diào)情況有所下

5、降。因此,MC-LR染毒也明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞原癌基因c-fos的表達(dá),而且染毒濃度越高,促進(jìn)作用越明顯。
　　原癌基因c-jun的mRNA水平在MC-LR處理8h時(shí),各濃度組和對(duì)照組相比均顯著上升,并且隨著染毒劑量的加大而升高。處理24 h時(shí)持續(xù)上調(diào)但高濃度組相對(duì)于低濃度組升高更為明顯,且各染毒組均上調(diào)到最高峰。48h和72 h各濃度組仍然上調(diào),但上調(diào)幅度下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因c-

6、jun的表達(dá)。
　　MC-LR染毒8h時(shí),各濃度組細(xì)胞c-myc的轉(zhuǎn)錄水平均較對(duì)照組升高并達(dá)到最高峰。24 h、48 h和72 h時(shí)各濃度組c-myc表達(dá)仍顯著上升,但相對(duì)于8h情況有所下降。因此,c-myc的表達(dá)隨著MC-LR暴露濃度的增加而顯著上調(diào)。
　　和對(duì)照組相比,各濃度MC-LR組(除10nM組)HepG2細(xì)胞N-ras的表達(dá)經(jīng)染毒8h均顯著上調(diào)。24h時(shí)繼續(xù)上調(diào),48h上調(diào)達(dá)到最高峰,72h上調(diào)情況有所下降,且隨

7、染毒濃度增加而加強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因N-ras的表達(dá)。
　　MC-LR染毒后,HepG2細(xì)胞抑癌基因PTEN的表達(dá)情況比較復(fù)雜。處理8h和24h比對(duì)照組明顯下調(diào),且高濃度組下調(diào)情況比低濃度組更為顯著。48h時(shí)仍顯著下調(diào),且0.5μM組、10μM組及50μM組下調(diào)達(dá)到最低水平。72h時(shí)50nM組、0.5μM組、10μM組及50μM組,表達(dá)均顯著下調(diào)。該檢測(cè)結(jié)果表明,MC-LR染毒明顯抑制

8、PTEN的表達(dá)。
　　3.MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞中原癌基因及抑癌基因蛋白表達(dá)水平的影響
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,MC-LR染毒處理上調(diào)原癌基因c-Met、c-Fos、c-Jun、c-Myc及N-Ras的蛋白水平,但下調(diào)PTEN的蛋白水平。該結(jié)果與MC-LR對(duì)其轉(zhuǎn)錄的影響結(jié)果一致。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,采用非細(xì)胞毒濃度的MC-LR染毒HepG2細(xì)胞后,極低劑量的MC-LR能分別于轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上調(diào)原