EphB2在B細胞活化中的作用和機制研究.pdf

1、第一部分 EphB2在B細胞上表達及其作用的初步研究
　　背景：EphB2是受體型酪氨酸激酶 Eph家族成員，主要表達于腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞上，可促進腫瘤細胞增殖和遷移及內(nèi)皮細胞簇集。近年研究發(fā)現(xiàn)，EphB2在T細胞和單核細胞上也有表達，并且其前向信號可促進T細胞遷移和單核細胞活化。然而，EphB2在B細胞上的表達及作用至今尚無明確報道。
　　方法：取健康志愿者靜脈血，分選出B淋巴細胞。分別利用LPS、anti-IgM和IL-

2、4刺激幼稚B細胞活化，以western blot檢測EphB2及其配體ephrinB1/B2蛋白表達情況。同時，通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA以抑制EphB2表達，并設(shè)立陰性對照siRNA（NC）轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組，檢測其對B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平的影響。
　　結(jié)果：EphB2及其特異性配體ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B細胞上均有表達，且體外刺激B細胞活化后，EphB2表

3、達顯著上調(diào)（P<0.05），而ephrinB1和ephrinB2表達均無明顯變化。同時，轉(zhuǎn)染siRNA并檢測B細胞活化指標，結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組相比，EphB2 siRNA轉(zhuǎn)染組B細胞增殖（P<0.05）、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著下降，然而各組之間IgM水平無明顯差異。
　　結(jié)論：EphB2及其配體ephrinB1/B2在人B細胞上有表達，且EphB2在B細胞活化中

4、起到重要的促進作用。
　　第二部分調(diào)控B細胞EphB2表達的microRNA的篩選和鑒定
　　背景： microRNA是一種內(nèi)源性的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA，通過與 mRNA特異性結(jié)合使其降解或抑制其翻譯為蛋白質(zhì)，并因其穩(wěn)定性、保守性及靶向結(jié)合的特異性，成為疾病分子靶向治療方面的研究熱點。有研究顯示，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞中，EphB2表達可受到多種microRNA的調(diào)控。因此，篩選出具有特異性調(diào)控 B

5、細胞 EphB2表達的 microRNA對進一步研究EphB2在B細胞中的作用機制有重要價值。
　　方法：利用miRWalk數(shù)據(jù)庫并綜合參考5種生物信息學(xué)分析結(jié)果，預(yù)測可調(diào)控人EphB2表達的microRNAs，并利用實時定量PCR檢測上述microRNAs在B細胞中的表達情況。之后，構(gòu)建含有EphB23’UTR結(jié)合位點的熒光霉素報告基因載體質(zhì)粒，并與miR-185模擬物或模擬物NC共轉(zhuǎn)染入工具細胞293T內(nèi)，檢測各組細胞的熒光值

6、，以驗證miR-185是否可與EphB2 mRNA特異性結(jié)合并影響EphB2表達。另外，通過轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞，并western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2（+）B細胞百分比和平均熒光強度，以進一步驗證miR-185是否可影響B(tài)細胞上EphB2的表達；同時，檢測B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平，以探究miR-185對B細胞活化的影響。
　　結(jié)果：miRWal

7、k數(shù)據(jù)庫預(yù)測出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204這6種microRNA可調(diào)控人EphB2表達。上述6種microRNA在人外周血幼稚B細胞中均有表達，然而只有miRNA-185， miRNA-515和 miRNA-204在活化的 B細胞中表達下調(diào)（ P<0.05），且與miRNA-515和miRNA-204相比，miRNA-185下調(diào)更為明顯（P<0.0

8、5）。熒光霉素報告基因結(jié)果顯示，含 EphB23’UTR野生型結(jié)合位點的報告基因與miRNA-185模擬物共轉(zhuǎn)染組細胞熒光測值下降41％（P<0.01）。進一步，我們分別轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞，檢測到與NC組和非轉(zhuǎn)染對照組相比，miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組中western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2（+）B細胞百分比和平均熒光強度均明顯下調(diào)（P<0.05），miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組中western

9、檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2（+）B細胞百分比和平均熒光強度均明顯上調(diào)（P<0.05）；同時，我們檢測各組B細胞活化指標，結(jié)果顯示，miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞增殖（P<0.05）、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著下降，miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組B細胞增殖（P<0.05）、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α（P<0.01）及IgG水平(P<0.05)均顯著上升。
　　結(jié)論：m

10、iR-185可特異性抑制B細胞上EphB2表達，從而阻礙B細胞活化。
　　第三部分EphB2調(diào)控B細胞活化的分子機制
　　背景：細胞活化的核心轉(zhuǎn)錄因子為NF-kB，其亞基p65是B細胞活化中的重要信號分子。在神經(jīng)細胞中，Src為EphB2下游的重要信號分子，可促進神經(jīng)突觸形成和重塑，且最近研究表明Src活化后可激活NF-kB(p65)分子。我們推測EphB2可能通過 Src-p65信號通路調(diào)控 B細胞活化。另外，一種新近發(fā)現(xiàn)

11、的信號分子Notch1可參與T細胞活化，但其在B細胞活化中的作用尚不明確。此部分我們將探究上述信號分子在EphB2調(diào)控B細胞活化中的作用。
　　方法：通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA或miR-185模擬物寡聚核苷酸以抑制B細胞EphB2表達，western blot分別檢測B細胞phospho-Src/總Src、phospho-p65/總p65及Notch1蛋白水平，以探究EphB2調(diào)控B細胞活化中可能激活的信號通路。
　　結(jié)

12、果：與對照組相比，EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞磷酸化Src表達顯著下調(diào)（P<0.05），各組B細胞總Src表達無明顯差異；磷酸化p65表達顯著下調(diào)（P<0.05），各組B細胞總p65表達無明顯差異。同時，EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞中Notch1的表達受到顯著抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：EphB2可能通過Src-p65信號通路調(diào)控B細胞活化，Notch1也在其中發(fā)揮重要