Rgg轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)高致病性2型豬鏈球菌毒力與代謝的調(diào)控研究.pdf

1、2 型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)是一種重要的人畜共患傳染病病原體, 可引起人和豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥甚至急性死亡，長(zhǎng)期以來給養(yǎng)豬業(yè)和相關(guān)從業(yè)人員健康均形成巨大威脅。在本課題組報(bào)道中國(guó)暴發(fā)的兩起大規(guī)模人感染SS2的公共衛(wèi)生事件之前，世界各地報(bào)道的人感染SS2 病例均為散發(fā)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，SS2 感染現(xiàn)已在中國(guó)形成暴發(fā)與散發(fā)共存的流行趨勢(shì)。我們通過比較基因組學(xué)分析證實(shí)，

2、在中國(guó)引發(fā)兩次大規(guī)模感染的SS2 強(qiáng)毒株基因組中均帶有一段89 kb 長(zhǎng)的DNA 片段，命名為89K，進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明89K 可能具有毒力島的功能。近年來，對(duì)SS2 致病性的研究越來越受到各國(guó)學(xué)者的重視，因此目前除了一些傳統(tǒng)已知的毒力因子如莢膜多糖和溶血素之外，也有一些新的毒力相關(guān)元件得以鑒定，如二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SalK-SalR、孤兒調(diào)控因子CovR、脂膜酸，等等。
　　 同其它很多致病菌一樣，SS2通過空氣傳播在動(dòng)

3、物的扁桃體定植，隨后突破免疫系統(tǒng)屏障，并通過血液循環(huán)擴(kuò)散到全身。為了在宿主體內(nèi)的不同器官中定植和生存，SS2 必須感受外界不斷變換的環(huán)境，高效率地產(chǎn)生響應(yīng)，從而精準(zhǔn)地調(diào)控特定基因的表達(dá)。由于隨時(shí)要涉及到眾多基因的協(xié)同作用，因此對(duì)細(xì)菌來說最有效率的方式莫過于通過眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相互作用，形成一個(gè)精密的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來大批量地調(diào)控整個(gè)基因組的表達(dá)。經(jīng)過長(zhǎng)期的研究，現(xiàn)在人們對(duì)化膿鏈球菌的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)有了很深入的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于SS2 來說這

4、方面的研究還很有限。Rgg家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子廣泛分布于各種革蘭氏陽性菌中，包括化膿鏈球菌、格氏鏈球菌、乳酸乳球菌等等。Rgg家族的N 端帶有一個(gè)螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋(HTH)的基序，以及對(duì)其發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能所必需的3個(gè)氨基酸保守殘基。從目前的報(bào)道來看，Rgg家族的調(diào)控因子在不同的細(xì)菌中執(zhí)行多種功能，例如控制葡萄糖代謝的通路，或者胞外蛋白的分泌，細(xì)菌素的表達(dá)，以及細(xì)菌對(duì)酸性環(huán)境的耐受等。實(shí)際上，化膿鏈球菌中的Rgg 調(diào)節(jié)因子還具有對(duì)基因組

5、進(jìn)行全局調(diào)控的功能，并能夠與該菌中的其它調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，調(diào)節(jié)細(xì)菌的代謝、生長(zhǎng)和毒力等多種生命活動(dòng)，使其能在不同的環(huán)境存活。
　　 本研究在SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33中鑒定了一個(gè)屬于Rgg家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并深入探討了其調(diào)控功能和分子機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
　　 1.對(duì)05ZYH33中rgg基因的鑒定、克隆和原核表達(dá)：經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，05ZYH33基因組中的rgg基因編碼一個(gè)287 aa的蛋白質(zhì)，在其N 端

6、有一個(gè)負(fù)責(zé)結(jié)合DNA的HTH基序，以及在Rgg家族調(diào)節(jié)因子中極度保守的3個(gè)氨基酸殘基，而且其氨基酸序列與其它革蘭氏陽性菌中的Rgg家族蛋白有較高的一致性。此外，我們利用pET-32a 原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)rgg基因進(jìn)行了體外表達(dá)，發(fā)現(xiàn)純化的重組蛋白可形成同質(zhì)二聚體，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的其它Rgg蛋白家族成員的特性相一致。
　　 2.Rgg基因的敲除與功能互補(bǔ)：我們先將壯觀霉素抗性基因(SpcR)克隆至pUC18質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，形成重

7、組質(zhì)粒pUC18-Spc，然后分別將rgg基因上下游的兩個(gè)DNA 片段克隆到pUC18-Spc 質(zhì)粒上SpcR基因的兩側(cè)，得到敲除載體pUC::rgg。將pUC::rgg 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化05ZYH33 感受態(tài)細(xì)菌，篩選具有壯觀霉素抗性的SS2菌落，采用組合PCR、Southern 雜交和RT-PCR等方法驗(yàn)證Rgg 編碼基因已被SpcR基因所替換，從而獲得具有壯觀霉素抗性的Rgg基因敲除突變株?rgg。隨后，PCR 擴(kuò)增出rgg基因及其上游

8、啟動(dòng)子序列，克隆至大腸桿菌－豬鏈球菌穿梭質(zhì)粒pSET1中，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化突變株?rgg的感受態(tài)，通過雙抗性篩選和RT-PCR 鑒定獲得Rgg 功能互補(bǔ)株C?rgg。
　　 3.Rgg 缺失對(duì)05ZYH33 微生物表型和毒力的影響：在相同培養(yǎng)條件下觀察野生株05ZYH33與?rgg 突變株在生物表型上差異。首先，通過革蘭氏染色與透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)突變株△rgg的鏈顯得更長(zhǎng)，細(xì)胞分裂發(fā)生異常，形成了一些大小不一的子細(xì)胞，而且有的細(xì)

9、胞形態(tài)發(fā)生了改變，兩端變尖呈梭形。其次，我們通過測(cè)OD600值繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，△rgg在生長(zhǎng)的前9小時(shí)內(nèi)大約比野生株約慢40％；但通過細(xì)菌涂板計(jì)數(shù)繪制卻發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)前9個(gè)小時(shí)中二者無明顯差異，當(dāng)野生株進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期，突變株繼續(xù)生長(zhǎng)直到二者的OD600值達(dá)到一致。第三，突變株△rgg的溶血活性和對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附性都顯著增強(qiáng)，仔豬感染實(shí)驗(yàn)證明，△rgg對(duì)動(dòng)物的致死率明顯下降，對(duì)兩組死亡動(dòng)物的病理學(xué)觀察也顯示突變株所致動(dòng)物組織的病變程度

10、明顯更輕。因此，Rgg 缺失突變實(shí)際上導(dǎo)致SS2對(duì)仔豬的致病性減弱。在功能互補(bǔ)株C?rgg中，上述生物學(xué)性狀均恢復(fù)得近似于野生株。
　　 4.突變株△rgg和野生株05ZYH33的基因表達(dá)差異研究：應(yīng)用基因芯片和熒光定量PCR等技術(shù)，我們從轉(zhuǎn)錄水平比較了野生株和突變株的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)Rgg缺失突變改變了345個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，占05ZYH33總基因數(shù)的15.87％，其中195個(gè)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，150個(gè)基因下調(diào)。上述基因可按功能

11、大致分為以下幾類：(1)上調(diào)的基因主要涉及蛋白質(zhì)的合成與修飾、DNA 復(fù)制與修復(fù)、細(xì)菌的防御機(jī)制等；(2)下調(diào)的基因主要是關(guān)于糖代謝方面的，尤其是各種非葡萄糖糖類的代謝過程；(3)一些與細(xì)胞的分裂繁殖和形態(tài)密切相關(guān)的基因改變了轉(zhuǎn)錄水平，可能導(dǎo)致了△rgg的鏡下形態(tài)發(fā)生明顯變化；(4)其中共有29個(gè)基因編碼已知或預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，說明Rgg是SS2基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，可與其它調(diào)控系統(tǒng)相互作用，共同響應(yīng)胞外信號(hào)發(fā)揮精確的全局調(diào)控功能

12、。
　　 綜上所述，本研究通過基因敲除獲得SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33的Rgg 缺失突變株，并結(jié)合基因芯片數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在轉(zhuǎn)錄水平分析突變株與野生株的基因表達(dá)差異，鑒定Rgg 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子控制的下游基因，證明Rgg在SS2基因組中發(fā)揮了全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，能夠在SS2的感染過程中上調(diào)各種非葡萄糖糖類代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平，改變細(xì)菌的糖代謝譜，同時(shí)下調(diào)一些非必需蛋白的表達(dá)，從而有助于SS2 適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境，能夠在新的營(yíng)養(yǎng)條件下生