分泌IL-17的T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在小鼠COPD發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一組以氣流受限為特征的肺部疾病，呈進(jìn)行性發(fā)展，是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，40歲以上人群患病率為8.2％，總體人群患病率為3％。世界銀行／世界衛(wèi)生組織公布，至2020年COPD將位居世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第5 位。近年隨著新型抗生素和以激素為主的抗炎藥物的應(yīng)用，COPD 急性加重期癥狀能夠得到有效的控制，緩解期的

2、生活質(zhì)量亦得以提高。
　　 但是，眾多措施都難以達(dá)到阻止COPD 發(fā)展進(jìn)程的效果。隨著對(duì)COPD的深入研究發(fā)現(xiàn)，COPD的發(fā)生是多因素共同參與的以呼吸道炎癥為核心的病理過程，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。
　　 IL-17是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，主要由Th17和γδT細(xì)胞分泌。Thl7細(xì)胞和γδT細(xì)胞主要介導(dǎo)慢性炎癥，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病及防御粘膜胞外菌感染中發(fā)揮重要作用。COPD 亦屬于多因素共同參與的呼

3、吸道慢性炎癥性疾病之一，那么，分泌IL-17的T細(xì)胞是否在COPD 發(fā)生、發(fā)展過程中起到誘導(dǎo)炎癥的作用？其作用機(jī)制和變化規(guī)律又是怎樣的？目前尚不清楚。
　　 成功建立標(biāo)準(zhǔn)化的COPD 動(dòng)物模型不僅有利于深入了解COPD 發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也有利于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。吸煙所致的有害氣體和有害顆粒是導(dǎo)致COPD 最常見的原因之一。本實(shí)驗(yàn)采用慢性紙煙煙熏的方法建立COPD小鼠模型，并探討分泌IL-17的T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在COPD 發(fā)病

4、中的作用，為COPD的臨床治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.建立COPD小鼠模型，觀察不同階段小鼠支氣管及肺組織病理學(xué)變化。
　　 2.觀察IL-17及相關(guān)細(xì)胞因子在COPD不同時(shí)期的變化，探討其變化的意義。
　　 3.觀察分泌IL-17的T細(xì)胞在COPD不同時(shí)期的變化，探討其在COPD 發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并明確IL-17 主要的細(xì)胞來源，為COPD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5、>　　 研究方法：
　　 1.將40只5周齡C57/BL6小鼠按照隨即數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組、熏4周組、熏8周組和煙熏12周組，煙熏組每日定量吸入香煙煙霧。
　　 2．眼球取血后斷頸處死動(dòng)物，收集一側(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清和BALF中IL-17、22和23 含量。
　　 3.采用密度梯度離心法分離肺組織中Th17、γδT細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各種細(xì)胞比例。

6、　　 4.采用HE、V.G 染色，觀察支氣管和肺組織病理變化。
　　 5. 利用Leica 彩色圖象處理系統(tǒng)測量測定支氣管內(nèi)面積與氣管外面積比值，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算BALF 炎癥細(xì)胞數(shù)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠體重增長緩慢，且煙熏3周后有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.煙熏組小鼠氣管、支氣管及肺組織有慢性支氣管炎、阻塞性肺氣腫的特征性病理改變，總體表現(xiàn)為纖毛

7、上皮部分剝脫，支氣管上皮和成纖維細(xì)胞增生變厚，粘液腺及杯狀細(xì)胞增生，管腔內(nèi)粘液聚集，氣道壁和小血管周圍肺泡區(qū)以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，同正常對(duì)照組相比，煙熏組小鼠的肺組織白細(xì)胞明顯增高(P<0.05)，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤為主；煙熏4周組小鼠纖毛上皮部分脫落，部分管腔內(nèi)有粘液增多；HE 染色提示，煙熏組氣道管壁較對(duì)照組逐漸增厚，氣道管壁內(nèi)徑與氣管外徑比值隨煙熏時(shí)間延長逐漸減小，煙熏8周組從開始出現(xiàn)顯著差異(p<0.05

8、)，肺組織肺泡壁破壞、融合，有肺氣腫的表現(xiàn)。V.G 染色提示，煙熏12周后，大小氣道膠原纖維增多，支氣管纖維化形成。
　　 5. 同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠BALF中IL-17 含量平均值隨煙熏時(shí)間的延長逐漸增高，且于煙熏后14天出現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，到12周達(dá)到最高值；同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠BALF中IL-23 含量隨煙熏時(shí)間的延長逐漸增高，且升高早于IL-17，于煙熏后第7天出現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

9、05)，到8周達(dá)到頂點(diǎn)，10周以后略有下降；同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠BALF中IL-22 含量于煙熏后第7天明顯升高(P<0.05)，而后隨煙熏時(shí)間延出現(xiàn)先升高后降低，于第8周達(dá)最低水平。
　　 6. 同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠肺組織中Th17細(xì)胞隨煙熏時(shí)間的延長而逐漸增高，于12周達(dá)頂點(diǎn)(P<0.05)；同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠肺組織中γδT細(xì)胞數(shù)隨煙熏時(shí)間的延長先增高后降低，其中在第8周時(shí)表現(xiàn)為最高(P＜0.05)

10、，12周時(shí)略有降低（P＞0.05）。同正常對(duì)照組比較，煙熏組小鼠肺組織中分泌IL-17的γδT細(xì)胞數(shù)在煙熏早期即有增多，在第4周達(dá)最高(P<0.05)；煙熏8周組結(jié)果較煙熏4周組略有降低（P＞0.05），而煙熏12周組結(jié)果同煙熏8周組無明顯差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用半定量紙煙煙熏方法，成功建立C57/BL6小鼠COPD 模型。
　　 2.IL-17 參與C57/BL6小鼠COPD的發(fā)生、

11、發(fā)展整個(gè)炎癥過程，起到炎癥誘導(dǎo)作用。IL-22在COPD的支氣管炎癥中起到促炎作用。IL-23在IL-17 升高之前即有增高，說明IL-23/IL-17通路可能參與了小鼠COPD的炎癥，提示IL-23/ IL-17通路可能是未來臨床COPD 炎癥調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)之一。
　　 3．小鼠COPD 發(fā)生發(fā)展過程中，Th17表達(dá)量大量增高，在維持小鼠COPD的炎癥中起主要作用，其中在COPD 早期分泌IL-17的γδT細(xì)胞起到炎癥的啟動(dòng)作