青藏高原土壤中低溫高效原油降解菌的篩選、鑒定及其降解特性的研究.pdf

1、隨著原油的廣泛開采、使用和運(yùn)輸，原油污染事故頻發(fā)。原油泄漏到土壤中會(huì)通過重力、表面張力和毛細(xì)現(xiàn)象向地表和地下擴(kuò)散，使土壤瀝青化和板結(jié)化，因此影響其透水性和透氣性，進(jìn)而使土壤失去肥力，同時(shí)污染地下水，最終危害動(dòng)植物生命并對(duì)人類產(chǎn)生“致癌，致畸性，致突變”的三致危害。相較于海洋環(huán)境中的原油污染，發(fā)生在土壤中的原油污染隱弊性大,潛伏期長(zhǎng)，涉及面廣，治理起來更加困難。祛除原油污染常用的方法有物理法、化學(xué)法及生物修復(fù)法。但是物理法和化學(xué)法有成本高

2、，操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備要求高，會(huì)產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)，而生物修復(fù)法是利用微生物自身的代謝來分解污染物，其最終產(chǎn)物是CO2、H2O等物質(zhì)，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染，被認(rèn)為是一種綠色的處理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、化學(xué)方法不易降解的物質(zhì)。所以說發(fā)展生物修復(fù)技術(shù)將極大的有利于原油污染治理工作。但是相較于常溫環(huán)境，生物修復(fù)技術(shù)在冷環(huán)境中的應(yīng)用又更加困難，低溫是生物修復(fù)技術(shù)中的一個(gè)重要限速條件。低溫不僅會(huì)減弱低分子量烷烴的揮發(fā)，使大分子量的烷烴

3、粘滯在土壤表面很難被降解，還會(huì)使微生物體內(nèi)細(xì)胞液的流動(dòng)性降低，催化降解污染物的酶活下降，微生物進(jìn)行生長(zhǎng)活動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪芰p弱，同時(shí)低溫還會(huì)影響核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性從而抑制DNA的復(fù)制、mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯。若溫度低于細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn)，細(xì)胞膜通道關(guān)閉，細(xì)胞質(zhì)凍結(jié)，污染物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都無法進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)還會(huì)形成冰晶體破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這樣細(xì)胞就會(huì)停止生命活動(dòng)。所以說研究低溫原油降解菌對(duì)生物修復(fù)技術(shù)在冷環(huán)境中的應(yīng)用是個(gè)極大的補(bǔ)充。青藏高原平均海拔40

4、00 m以上，常年處于低氣溫，長(zhǎng)日照的環(huán)境中，是地球上重要的冷環(huán)境之一。近些年來，由于青藏工程走廊的建設(shè)和運(yùn)營(yíng)，還有相關(guān)旅游業(yè)的發(fā)展，已經(jīng)給這個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境帶來了不同程度的烴類物質(zhì)污染，而青藏高原的生態(tài)環(huán)境極為敏感和脆弱，一旦被破壞后很難恢復(fù)，所以加強(qiáng)對(duì)此地區(qū)原油污染的防治工作十分重要。而已有研究表明青藏高原土壤中有豐富的微生物資源，包括嗜冷微生物和耐冷微生物。所以此次研究以青藏高原土壤為樣本，分離具有低溫原油降解活性的細(xì)菌菌株，研究

5、所篩菌株的原油降解特性，為冷環(huán)境原油污染生物修復(fù)提供微生物菌種資源。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴分別在青藏公路沿線班戈橋（BGQ）、沱沱河（TTH）、五道梁（WDL）、北麓河（BLH）、烏麗（WL）、開心嶺（KXL）、雁石坪（YSP）、唐古拉山南（TGL）、安多（AD）和當(dāng)雄（DX）10個(gè)樣點(diǎn)取樣。在10℃條件下篩選并分離到原油降解活性最高的細(xì)菌2株，菌株編號(hào)為BGQ-6和DX-7。經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序比對(duì)及GENⅢ鑒定板分

6、析，確定菌株BGQ-6為Rhodococcus qingshengii（KF704114），與最相似模式菌株Rhodococcus qingshengii djl-6T(DQ090961)的相似度為100％，歸屬于放線菌門；DX-7為Acinetobacter calcoaceticus（KF704064），與最相似模式菌株Acinetobacter calcoaceticusDSM30006T(AIEC01000170)的相似度為99

7、.93%，歸屬于變形菌門。已經(jīng)分離到的原油降解菌也多歸屬于變形菌門和放線菌門。
　?、圃?0℃、150rpm條件下對(duì)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)15d后，用GC-MS法測(cè)定菌株BGQ-6和DX-7對(duì)原油總量及其中含量最高的60種烴類物質(zhì)的降解率，通過GC-MS檢測(cè)，這60種烷烴物質(zhì)分別歸屬于5類：直鏈烷烴，支鏈烷烴，環(huán)烷烴，芳香烴和支鏈烯烴。結(jié)果表明：菌株BGQ-6對(duì)原油的總降解率為74.14%，對(duì)其余5種物質(zhì)的降解率依次為：直鏈烷烴7

8、7.55%、支鏈烷烴59.32%、環(huán)烷烴44.80%、芳香烴76.06%、支鏈烯烴93.69%；其中，菌株BGQ-6對(duì)短直鏈烷烴C10的降解率為98.43%，對(duì)中鏈烷烴降解率在80%左右，對(duì)碳原子數(shù)大于20的長(zhǎng)鏈烷烴的降解率在60%~80%，對(duì) C28和C29的降解率相對(duì)較低。菌株BGQ-6對(duì)大部碳原子數(shù)在12~26之間的支鏈烷烴的降解率為60%左右。DX-7對(duì)原油的總降解率為45.9%，對(duì)其余5種物質(zhì)的降解率依次為：直鏈烷烴48.95

9、%、支鏈烷烴46.32%、環(huán)烷烴41.67%、芳香烴43.27%、支鏈烯烴49.75%；其中，對(duì)短直鏈烷烴的降解率>90%，對(duì)大部分中直鏈烷烴的降解率只有50%左右，而在長(zhǎng)直鏈烷烴的降解率上較菌株BGQ-6有明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)大部分支鏈烷烴的降解率都在50%左右，只有對(duì)2-methyl-octadecane(碳原子數(shù)為19)的降解率較低，為4.68%。DX-7和菌株BGQ-6對(duì)環(huán)烷烴的降解率幾乎一致，均為50%左右，對(duì)不飽和烴降解率最高。

10、r>　?、抢貌煌飳?duì)菌株BGQ-6和DX-7基因組中與烷烴降解相關(guān)的基因進(jìn)行PCR，結(jié)果表明這兩株菌中都含有alkB（編碼烷烴羥化酶)和almA（編碼黃素單加氧酶)基因，而不含有P450（編碼細(xì)胞色素)、ndoB（編碼萘雙加氧酶)和xylE（編碼2，3-鄰苯二酚雙加氧酶)基因。通過構(gòu)建克隆文庫確定了菌株BGQ-6基因組中存在4個(gè)alkB家族成員和1個(gè)almA基因拷貝，GenBank登錄號(hào)分別為 alkB1(HG530382)、alk

11、B2(HG530385)、alkB3(HG530379)、alkB4(HG530384)和almA(HG530364)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明alkB1、alkB2和alkB4分別與同屬中的三個(gè)菌株最相似，相似度都在90%以上；alkB3與Geobacillus subterraneus中的alkB基因相似性為93%；而almA與其相似度最高的almA相似值僅為73%且覆蓋度不到50%。DX-7基因組中分別有1個(gè)alkB基因拷貝和1個(gè)almA

12、基因拷貝，登錄號(hào)分別為alkB(HG530364)和almA(KF802199)。
　?、却舜窝芯抗埠Y選出6株不動(dòng)桿菌，通過對(duì)不動(dòng)桿菌屬兩個(gè)特殊看家基因rpoB和gyrB的檢測(cè)，分離自沱沱河和唐古拉山的兩株不動(dòng)桿菌為潛在新種，其編號(hào)分別為TTH0-4和TGL-Y2。對(duì)TTH0-4株菌進(jìn)行了鑒定，通過DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)確定該菌為新種，并借助Biolog GEN III鑒定板API20NE和API ZYM，以及掃描電鏡等手段獲得了