胱硫醚-γ-裂解酶-硫化氫體系在富氫水減輕內(nèi)毒素所致的急性肝損傷中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、急性肝損傷（actue liver injury，ALI）可由多種原因引起，主要病理特征為肝組織內(nèi)單核巨噬細(xì)胞廣泛受損而致的肝組織充血水腫，臨床上可表現(xiàn)為肝功能下降，黃疸，貧血和低蛋白血癥等，進(jìn)一步發(fā)展至急性肝功能衰竭。多種病因（包括肝內(nèi)/肝外，感染/非感染）都能直接或間接引起急性肝功能衰竭。革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是導(dǎo)致肝臟感染和全身感染的主要因素。LPS刺激肝細(xì)胞分泌炎

2、性因子而介導(dǎo)啟動(dòng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），在肝臟可表現(xiàn)為ALI。然而對(duì)于LPS啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致ALI的具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　 氫氣是無色、無嗅、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。在生物醫(yī)學(xué)界，過去氫氣一直被認(rèn)為屬于生理性惰性氣體而僅僅用于潛水醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。自從Ohsawa等[1]發(fā)現(xiàn)氫氣具有抗氧化抗凋亡的特點(diǎn)，

3、可以通過選擇性的中和羥自由基保護(hù)缺血再灌注損傷和休克以來，氫氣作為治療性醫(yī)學(xué)氣體成為了研究熱點(diǎn)。大量的生物醫(yī)學(xué)臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，無論氫氣是通過呼吸還是通過水溶液（可制成飽和氫生理鹽水，簡(jiǎn)稱富氫水）進(jìn)入機(jī)體都可以作為選擇性羥自由基和亞硝酸陰離子清除劑產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。有研究表明氫氣對(duì)器官缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多問題亟待解決。
　　 內(nèi)源性氣體信號(hào)分子是一類具有多種生理和病理生理作用的生物物質(zhì)

4、，它們的發(fā)現(xiàn)為ALI發(fā)病機(jī)制的研究開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。迄今已證實(shí)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子有三種，即一氧化氮(nitric oxide,NO)，一氧化碳（carbon monoxide，CO）和硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)。H2S是繼NO和CO之后被確認(rèn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。它是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛-5’-磷酸依賴性酶[包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ

5、-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)]等催化產(chǎn)生的。已有研究證實(shí)H2S參與了神經(jīng)和血管等的生理功能調(diào)節(jié)，以及高血壓、肺動(dòng)脈高壓、內(nèi)毒素休克等疾病的發(fā)生。所以，本研究中，我們旨在探明H2S在LPS所致ALI中所發(fā)揮的作用及機(jī)制。
　　 研究表明，肝臟內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞的活化和損傷在LPS所致的ALI中發(fā)揮重要作用。LPS介導(dǎo)的肝庫(kù)否氏細(xì)胞活化的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為L(zhǎng)PS-TNF-α-JNK-IκB-N

6、F-κB是其中一條關(guān)鍵的信號(hào)通路，即LPS激活肝內(nèi)庫(kù)否氏細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的細(xì)胞因子TNF-α和ROS等，而這些因素可以直接激活肝細(xì)胞中JNK促使iκbα磷酸化降解，然后順次激活下游激酶(NF-κB誘導(dǎo)激酶，NF-κB-inducing kinase，NIK)，激活的NIK能獨(dú)自激活I(lǐng)KK復(fù)合物，導(dǎo)致IκB磷酸化降解，NF-κB移位入核，導(dǎo)致細(xì)胞因子TNF-α，IL-6等轉(zhuǎn)錄，合成增加，白細(xì)胞活化浸潤(rùn)，加重肝炎癥反應(yīng)和肝損傷。
　

7、　 富氫水對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肝組織中CSE表達(dá)有何作用，它是否通過調(diào)控CSE/H2S來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，以及TNF-α-JNK-NF-κB通路是否參與富氫水對(duì)LPS誘導(dǎo)的CSE表達(dá)的調(diào)控均未見報(bào)道。本研究通過觀察富氫水對(duì)LPS所致的ALI的保護(hù)作用，以及CSE/H2S對(duì)富氫水在該過程中作用的影響及TNF-α/JNK/NF-κB通路在此過程中的作用，以探討CSE/H2S體系在富氫水抗LPS所致的ALI中的作用，為臨床防治ALI提供新的對(duì)

8、策。
　　 1內(nèi)、外源性H2S在富氫水減輕內(nèi)毒素所致急性肝損傷中的作用本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察內(nèi)、外源性H2S在富氫水抗LPS所致的ALI中的作用。將84只雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組（每組12只）:①對(duì)照組:尾靜脈注射等體積的生理鹽水（與LPS的體積相同）;②LPS組:尾靜脈注射LPS10mg/kg（lmg/ml）;③NaHS(H2S供體)+LPS組:在注射LPS（劑量同前）前10min經(jīng)腹腔注射0.5mlNaHS(28μmol/k

9、g);④PPG（炔丙基甘氨酸，CSE抑制劑）+LPS組:在注射LPS（劑量同前）前10min經(jīng)腹腔注射0.5mlPPG(45μmol/kg);⑤H2+LPS組:在注射LPS（劑量同前）前20min經(jīng)腹腔注射H2水8ml/kg，注射LPS之后每隔1h給予H2水8ml/kg連續(xù)5次;⑥PPG+H2+LPS組:在注射LPS（劑量同前）前20min先腹腔注射H2水（劑量，用法同前），10min后再腹腔注射PPG（劑量同前）;⑦H2組（H組）:在

10、注射生理鹽水前20min經(jīng)腹腔注射H2水（劑量，用法同前）。連續(xù)觀察6h，留取血漿以檢測(cè)肝生化指標(biāo)，TNF-α水平及H2S含量，留取肝右葉，用于制備肝組織勻漿以測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，谷胱甘肽(glutathione，SGH)含量，部分肝組織用于提取組織總蛋白以Western blot方法測(cè)定Smac和Caspase-3，4％多聚甲醛固定部分肝右葉，常規(guī)石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色以觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。

11、
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):①注射LPS后，大鼠血清中ALT, AST, TBIL和TNF-α水平與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05)。可見肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞呈廣泛氣球樣變，其數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。與對(duì)照組比較，LPS可使肝組織Smac和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，肝組織中MDA含量升高(P＜0.05)，GSH含量顯著下降(P＜0.05)。
　　 ②與LPS組相比，H2+L

12、PS和NaHS+LPS組血清中肝功酶和TNF-α水平顯著降低(P＜0.05)。肝細(xì)胞氣球樣變數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。肝組織中Smac和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，肝組織MDA含量降低(P＜0.05)，GSH含量顯著升高(P＜0.05)。PPG可使肝組織中Smac和Caspase-3表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，肝組織MDA含量增加(P＜0.05)，GSH含量減少(P＜0.05)，加重LPS導(dǎo)致的肝組織損傷的

13、程度并抑制富氫水的保護(hù)作用。
　　 ③注射LPS引起ALI時(shí)，血漿中H2S含量減少。富氫水和NaHS可逆轉(zhuǎn)LPS的上述作用，與LPS組相比，其血漿中H2S含量增加(P＜0.01)。PPG則促進(jìn)LPS對(duì)H2S的下調(diào)作用(P＜0.05)。
　　 以上結(jié)果表明，LPS可引起明顯的肝組織損傷并下調(diào)H2S的生成量。應(yīng)用富氫水和H2S供體NaHS可上調(diào)H2S，并減輕肝損傷。提示富氫水細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮與H2S的產(chǎn)生之間可能具有某種內(nèi)

14、在聯(lián)系，它可能通過增加H2S的產(chǎn)生來發(fā)揮抗氧化、抑制TNF-α分泌等作用，從而改善了LPS誘導(dǎo)的肝損傷。
　　 2 CSE/H2S體系在富氫水減輕內(nèi)毒素所致的急性肝損傷中的作用機(jī)制
　　 2.1富氫水減輕內(nèi)毒素所致大鼠急性肝損傷過程中肝組織CSE表達(dá)的變化本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察富氫水改善LPS所致的肝損傷過程中肝組織CSE活性和CSE mRNA表達(dá)的變化，以闡明富氫水調(diào)控LPS誘導(dǎo)H2S生成的分子機(jī)制及其可能的生物學(xué)意義

15、。將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組12只，給藥方法同前）:①對(duì)照組:方法同第一部分①;②LPS組:方法他第一部分②;③H2+LPS組:方法同第一部分⑤;④H2組:方法同第一部分⑦，于給藥后6h處死。取肝右葉部分用于制備肝組織勻漿以檢測(cè)CSE活性，部分用于提取組織總RNA以RT-PCR方法檢測(cè)CSE mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果如下:與對(duì)照組相比，LPS組大鼠肝組織CSE mRNA表達(dá)減少，CSE蛋白活性下降(P＜0.05)

16、。與LPS組相比，H2+LPS組肝組織CSE mRNA表達(dá)增多，CSE蛋白活性升高;與對(duì)照組相比，H2組大鼠肝組織CSE活性及CSE mRNA表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。
　　 結(jié)合第一部分的結(jié)果提示，H2S/CSE體系參與了LPS所致ALI的病理生理過程。富氫水可能通過上調(diào)CSE mRNA表達(dá)和蛋白活性而發(fā)揮肝保護(hù)作用。富氫水增加LPS所致ALI大鼠肝組織中H2S的產(chǎn)生有可能是通過CSE表達(dá)上調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。
　　 2

17、.2JNK/SAPK通路在富氫水上調(diào)內(nèi)毒素所致急性肝損傷大鼠肝組織CSE表達(dá)中的作用及對(duì)NF-κB的影響
　　 本部分實(shí)驗(yàn)的目的是通過觀察應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125進(jìn)一步探討富氫水上調(diào)ALI大鼠肝組織中CSE表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。將84只大鼠，隨機(jī)分為7組，每組12只。①對(duì)照組:方法同第一部分①;②LPS組:方法同第一部分②;③SP600125（JNK抑制劑）+LPS組:在注射LPS前30min經(jīng)腹腔注射SP60012

18、55mg/kg;④H2+LPS組:方法同第一部分⑤;⑤SP600125+H2+LPS組:在注射LPS前30min經(jīng)腹腔注射SP600125（劑量同前），前20min腹腔注射H2水（劑量同前）;⑥H2組:方法同第一部分⑦;⑦SP600125組（S組）:在注射生理鹽水前30min經(jīng)腹腔注射SP600125（劑量同前）各組給藥6h后麻醉取材（方法同前）。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK特異性的抑制劑SP600125進(jìn)一步上調(diào)了富氫水誘導(dǎo)的CS

19、EmRNA表達(dá)和CSE蛋白活性，提示JNK通路在富氫水上調(diào)LPS所致ALI大鼠肝組織CSE表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用;SP600125和富氫水抑制了肝組織NF-κB蛋白表達(dá)，降低了血清中TNF-α水平，提示CSE對(duì)JNK-NF-B通路可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)觀察了CSE/H2S體系在富氫水減輕LPS所致ALI中的作用，并探討了在此過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為其在臨床上應(yīng)用提供了新的、可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)

20、。
　　 1 LPS可引起明顯的肝組織損傷，同時(shí)血漿H2S含量下降;抑制內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生，可加重LPS所致的ALI，提示H2S具有抗肝損傷作用，其機(jī)制可能與其抑制TNF-α的分泌及由此引起的炎癥反應(yīng)和氧化損傷有關(guān)。富氫水可減輕肝損傷的同時(shí)上調(diào)血漿H2S含量。富氫水細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮與內(nèi)源性H2S生成之間可能具有某種內(nèi)在聯(lián)系。
　　 2富氫水通過上調(diào)CSEmRNA和CSE蛋白表達(dá)增加而發(fā)揮肝保護(hù)作用。并在整體水平證實(shí)富氫