蛋白質(zhì)和DNA多組分化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)和DNA的多組分同時(shí)檢測(cè)是目前臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、微生物檢驗(yàn)等領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，具有分析通量高、所需時(shí)間短、樣品消耗少、分析成本低等突出優(yōu)點(diǎn)。目前多組分檢測(cè)通常采用標(biāo)記物識(shí)別模式或空間位置識(shí)別模式，但由于受到標(biāo)記物數(shù)目以及所用儀器設(shè)備較為昂貴等因素的影響，在一定程度上限制了多組分檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
　　 化學(xué)發(fā)光(CL)分析法不需光源，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，具有極高的靈敏度，已成為近年來一個(gè)非常活躍的研究領(lǐng)域，目前已

2、成功地應(yīng)用在藥學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境學(xué)等諸多領(lǐng)域。為此，本論文采用化學(xué)發(fā)光分析法，利用不同載體物化性質(zhì)差異分離識(shí)別不同待測(cè)物，發(fā)展了三種具有創(chuàng)新意義的多組分同時(shí)檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了同一份樣品中多組分的同時(shí)檢測(cè)，整個(gè)論文由以下四部分構(gòu)成：
　　 第一章：緒論
　　 本緒論由三節(jié)構(gòu)成，其中第一節(jié)簡(jiǎn)單介紹了基于標(biāo)記物識(shí)別模式的多組分檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展及其意義，主要內(nèi)容包括：熒光標(biāo)記、金屬標(biāo)記、酶標(biāo)記等，并列舉了近年

3、來它們?cè)谠摲治鲱I(lǐng)域的部分典型示例；第二節(jié)中介紹了基于空間位置識(shí)別模式的多組分檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展及其意義，也列舉了近年來它們?cè)谠摲治鲱I(lǐng)域的部分典型示例；第三節(jié)闡述了本博士論文的目的、意義、主要研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新之處。
　　 第二章：基于不同載體的無標(biāo)記多組分DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)
　　 無標(biāo)記簡(jiǎn)單快速檢測(cè)特定序列DNA在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有非常重要的意義，尤其是無標(biāo)記多組分同時(shí)檢測(cè)技術(shù)，本章基于特異性化學(xué)發(fā)光試劑3，

4、4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與鳥嘌呤(G)堿基之間的瞬時(shí)衍生反應(yīng)，能夠產(chǎn)生CL的原理，實(shí)現(xiàn)了單份樣品中無標(biāo)記多組分特定序列DNA的同時(shí)檢測(cè)。具體采用磁珠、聚苯乙烯微球和溫度敏感高分子(PNIP)三種載體，以乙型肝炎病毒(HBV)的三條DNA合成片段為例，優(yōu)化構(gòu)建了新型的基于不同載體的無標(biāo)記多組分DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)。整個(gè)分析過程由以下兩步構(gòu)成：(1)分別制備三種載體修飾探針、混合后與以上三條DNA合成片段在同一試管中雜交；

5、(2)依據(jù)三種載體的物化性質(zhì)差異分離洗滌，利用TMPG與目標(biāo)DNA中的G堿基之間的瞬時(shí)衍生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性CL來定量三條DNA合成片段。結(jié)果表明：該方法具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快和靈敏度高等特點(diǎn)，目標(biāo)序列在0.1-6 pmol范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，最低檢測(cè)限可達(dá)100 fmol。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，隨后又采用G30放大檢測(cè)技術(shù)，在載體修飾探針與DNA合成片段雜交后，再與一段富含G的放大序列(含有兩個(gè)功能序列段：一是能夠與目標(biāo)序

6、列的15個(gè)核苷酸單位雜交的序列段，另一個(gè)是富含G的放大信號(hào)序列段-(T2G15)2)進(jìn)行第二次雜交，最低檢測(cè)限可達(dá)15 fmol。方法選擇性研究表明：本法對(duì)單堿基錯(cuò)配和完全不互補(bǔ)序列有較好的識(shí)別能力。綜合而言：這種新型的載體識(shí)別無標(biāo)記多組分DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，不同于目前的多組分編碼策略，首次采用不同載體物理化學(xué)差異分辨、瞬時(shí)衍生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來同時(shí)檢測(cè)三種目標(biāo)序列DNA；其次采用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的CL分析法來替代目前常用于多組分

7、檢測(cè)的流動(dòng)注射或成像系統(tǒng)等昂貴設(shè)備，有望為臨床、環(huán)境、生物防護(hù)等領(lǐng)域的DNA多組分定量分析提供有價(jià)值的手段。
　　 第三章：基于不同載體的無標(biāo)記多組分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)
　　 第二章測(cè)定HBV的PCR真實(shí)樣品的研究過程中發(fā)現(xiàn)：雙鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(PCR amplicon)只有一條鏈與探針互補(bǔ)，所以在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)，探針會(huì)與擴(kuò)增產(chǎn)物另一條鏈存在競(jìng)爭(zhēng)雜交，這將顯著降低檢測(cè)靈敏度；不對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)的使

8、用雖可改善檢測(cè)靈敏度，但PCR擴(kuò)增效率也會(huì)因引物量的減少而下降。為此，本章旨在設(shè)計(jì)能夠直接進(jìn)行雙鏈PCR產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)的載體識(shí)別無標(biāo)記多組分檢測(cè)新技術(shù)，進(jìn)一步提高和發(fā)展第二章所構(gòu)建的無標(biāo)記多組分檢測(cè)技術(shù)，具體分析過程由以下三步構(gòu)成：(1)通過改造上游引物的方式使三條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上分別標(biāo)記地高辛(digoxin)，生物素(biotin)和熒光素(FITC)；(2)三條標(biāo)記物修飾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物分別與相應(yīng)的標(biāo)記有抗地高辛(anti-

9、digoxin)，鏈霉親和素(SA)，抗熒光素(anti-FITC)的載體混合物發(fā)生免疫反應(yīng)；(3)依據(jù)三種載體的物化性質(zhì)差異分離洗滌，利用TMPG與PCR產(chǎn)物中的G堿基之間的瞬時(shí)衍生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性CL來定量三條PCR產(chǎn)物。相比于目前的PCR檢測(cè)方法，本法具有以下特點(diǎn)，第一，傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)多采用PCR產(chǎn)物95℃加熱解鏈實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)，我們的檢測(cè)可直接檢測(cè)雙鏈PCR產(chǎn)物，無需將雙鏈DNA加熱變性，避免了競(jìng)爭(zhēng)雜交對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響

10、；第二，多組分實(shí)時(shí)PCR技術(shù)必須采用發(fā)射波長(zhǎng)不相互交叉的熒光標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)；本法采用瞬時(shí)衍生載體分辨無標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，直接進(jìn)行雙鏈PCR產(chǎn)物的多組分同時(shí)檢測(cè)；第三，實(shí)時(shí)PCR儀器設(shè)備相對(duì)昂貴，而化學(xué)發(fā)光儀儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便。綜合而言，本章發(fā)展的載體分辨無標(biāo)記多組分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)，具有簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高等特點(diǎn)，有望在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、微生物檢驗(yàn)等領(lǐng)域發(fā)揮作用。
　　 第四章：基于溫度敏感的四種蛋

11、白質(zhì)同時(shí)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光新技術(shù)
　　 鑒于以上兩章中多組分DNA檢測(cè)技術(shù)取得的成果，本章嘗試將這種新型的載體分辨化學(xué)發(fā)光技術(shù)拓寬至多種蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。為此，本章以免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和蛋白多肽藥物GH作為四個(gè)模型蛋白質(zhì)分析物，采用磁珠和溫敏高分子兩種載體以及堿性膦酸酯酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP)兩種標(biāo)記物，構(gòu)建了一個(gè)均相的非競(jìng)爭(zhēng)的ELISA反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了四種蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光同時(shí)檢測(cè)。整個(gè)分析過程由以下三步構(gòu)成：(

12、1)分別制備兩對(duì)第一抗體偶聯(lián)物：抗IgG-磁珠、抗IgM-磁珠、抗IgA-PNIP和抗GH-PNIP，混合并與四種抗原混合物IgG、IgM、IgA和GH在同一試管中進(jìn)行免疫反應(yīng)；(2)再與四種標(biāo)記了HRP、AP的第二抗體混合物進(jìn)行夾心反應(yīng)；(3)依據(jù)兩種載體的性質(zhì)差異進(jìn)行分離洗滌，將兩種載體各均分兩份，用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明：該法IgG、IgM、IgA和GH的檢測(cè)限分別為0.5，0.5，1.0和0.5 ng/mL。此外，還