家兔γ干擾素原核表達、抗病毒活性以及單克隆抗體的研究.pdf

1、干擾素是人和其他動物機體內(nèi)非常重要的一種細胞因子，在特定誘導(dǎo)劑的作用下，由效應(yīng)細胞產(chǎn)生并分泌，具有廣譜抗病毒活性、抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)免疫功能。按照國際通用的分類標準，干擾素主要分為三大類，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，而且Ⅱ型干擾素只包含IFN-γ一個成員。IFN-γ是由CD4+Th1、CD8+T細胞以及NK細胞受特異或非特異性抗原刺激后產(chǎn)生的糖蛋白，天然形式為N-糖基化的同源二聚體，具有一定的種屬特異性。IFN-γ

2、除了具有抗病毒活性之外，還參與免疫調(diào)節(jié)和MHC（主要組織相容性復(fù)合體）抗原的表達，也可以控制細胞生長。
　　利用基因工程技術(shù)表達的干擾素與天然干擾素不僅在生物學(xué)活性方面高度相似，并且還具有純度高、產(chǎn)量大、同批次產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定一致、適合規(guī)模化工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點;更加重要的是，通過基因工程技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)干擾素能夠大大降低經(jīng)濟成本，這一點對于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大面積推廣應(yīng)用干擾素非常有利。本研究中，利用基因工程技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白組學(xué)技術(shù)

3、等相關(guān)技術(shù)獲得重組兔γ干擾素，研究其抗病毒功能以及制備單克隆抗體，為兔γ干擾素工業(yè)化生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　利用RT-PCR技術(shù)從ConA刺激后的家兔外周血淋巴細胞中擴增兔γ干擾素（IFN-γ）基因，獲得大小約為504bp左右的目的片段。然后將其克隆、轉(zhuǎn)化入pET-28a(+)原核表達載體上，構(gòu)建重組載體pET-28a-IFN-γ。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)、HisTrap親和柱純化獲得大小

4、約為18KDa左右的IFN-γ重組蛋白。
　　大量表達重組兔IFN-γ蛋白，然后進行蛋白復(fù)性，從而獲得有活性的IFN-γ蛋白。利用微量細胞病變抑制法測定重組兔IFN-γ蛋白的抗病毒效果。結(jié)果如下:(1)利用VERO細胞進行測定，重組兔IFN-γ蛋白抗VSV活性為2.51×103U/mL，蛋白濃度為0.556mg/mL，比活性是4.51×103U/mg。(2)利用MDCK細胞進行測定，重組兔IFN-γ蛋白抗VSV活性為3.98×10

5、3U/mL，蛋白濃度為0.556mg/mL，比活性是7.16×103U/mg。結(jié)果表明，重組兔IFN-γ可以在體外抑制VSV對細胞的毒害作用。
　　用純化的重組兔IFN-γ蛋白免疫BALB/c小鼠，制備脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)過篩選和克隆化，共獲得4株能穩(wěn)定分泌兔IFN-γ單克隆抗體(mAbs)的雜交瘤細胞株，分別被命名為3H8、4G4、4F10、6C12，亞型分別為IgG1、κ鏈，IgG2b、κ鏈，IgG1、κ