全細(xì)胞直接注射法生產(chǎn)牛克隆胚胎的研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植研究中，克隆胚胎的構(gòu)建主要有兩種方法：電融合法和直接注射法。傳統(tǒng)的電融合法雖然操作簡便，重復(fù)性強(qiáng)，但是因?yàn)槠淙诤下氏鄬^低，儀器設(shè)備昂貴，操作時(shí)間長等缺陷而限制了它的大范圍推廣。相對于電融合法而言，胞質(zhì)內(nèi)直接注射法對卵母細(xì)胞和供體核的操作快速有效，減輕了對受體和供體的損傷，同時(shí)將供體細(xì)胞質(zhì)對重構(gòu)胚發(fā)育的影響降低到最低程度。已知獲得克隆后代的供體細(xì)胞類型中，卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的核移植效率比較理想。本文以這兩種體細(xì)胞為

2、供體對全細(xì)胞直接注射法克隆的一些因素進(jìn)行研究。
　　 本研究主要研究結(jié)果如下：
　　 試驗(yàn)1．在兩種不同去核方法的比較實(shí)驗(yàn)中，將改良的Willadesn去核法（點(diǎn)壓法）與盲吸去核法的去核效率進(jìn)行了比較。雖然兩種去核方法的去核效率(65.57％和68．．8%，P＞0.05)沒有顯著差異，但是點(diǎn)壓法操作簡便，去核時(shí)間短。
　　 試驗(yàn)2．為了確定最佳的牛重構(gòu)胚激活方法，將體外成熟的牛卵母細(xì)胞經(jīng)511mol/L Iono

3、phore、CH、Ionophhore+6-DMAP3種不同的激活方法激活，然后在mSOF內(nèi)培養(yǎng)，24h后各組之間卵裂率沒有顯著差異（49.27%、48.02%和53.59%，P＜0.05）：培養(yǎng)7d后，孤雌激活卵母細(xì)胞在Ionophore+6-DMAP組的囊胚率顯著高于Ionophore組和CH組(46.31%、26.55%和27.75%)，Ionophore組和CH組的囊胚率之間沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　 試驗(yàn)3.

4、在確定供體細(xì)胞類型對核移植影響的實(shí)驗(yàn)中，以新鮮卵丘細(xì)胞、原代卵丘細(xì)胞和第3代顆粒細(xì)胞為供體進(jìn)行核移植。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示新鮮卵丘細(xì)胞組、原代卵丘細(xì)胞組和第3代顆粒細(xì)胞組的卵裂率之間沒有顯著差異(38.18%、41.35%和39.86%，P＞0.05)。新鮮卵丘細(xì)胞組、原代卵丘細(xì)胞組和第3代顆粒細(xì)胞組的囊胚率Ⅰ之間沒有顯著差異(38.10%、39.62%和40.35%，P＞0.05)。新鮮卵丘細(xì)胞組、原代卵丘細(xì)胞組和第3代顆粒細(xì)胞組的囊胚率Ⅱ之

5、間沒有顯著差異(15.46%、16.41%和16.08%，P＞0.05)。
　　 試驗(yàn)4．在研究不同處理供體細(xì)胞的試驗(yàn)中，以血清饑餓3天的原代卵丘細(xì)胞、匯合3d的原代卵丘細(xì)胞和匯合4d的原代卵丘細(xì)胞為供體進(jìn)行核移植。研究結(jié)果顯示各組之間的卵裂率(分別為：41.97%、41.35%和39.69%)和囊胚率Ⅰ(31.15%、32.83%和34.61%)以及囊胚率Ⅱ(12.93%、13.58%和13.74)之間都沒有顯著差異(P＞0.

6、05)。表明完全融合的細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)體外培養(yǎng)后可以獲得較高的囊胚率，血清饑餓對牛重構(gòu)胚的發(fā)育不是必需的。
　　 試驗(yàn)5．在研究注核與激活間時(shí)間間隔對重構(gòu)胚發(fā)育影響的研究中，采用了注核后立即激活，注核3h后激活和注核4h后激活3種不同的激活策略對牛重構(gòu)胚進(jìn)行激活，然后轉(zhuǎn)移到mSOF中進(jìn)行培養(yǎng)7d并統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)24h后立即激活組的卵裂率(27.83%)顯著低于注核3h后激活組和注核4h后激活組的卵裂率(33.93

7、%和35.46%，P＜0.05)，培養(yǎng)7d后立即激活組的囊胚率(31.25%)顯著低于注核3h后激活組和注核4h后激活組(36.84%和38.00%，P＜0.05)；Ⅱ組和Ⅲ組之間的卵裂率和囊胚率之間都沒有顯著差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明延遲激活有利于重構(gòu)胚的發(fā)育，可以提高克隆效率。
　　 試驗(yàn)6．為了研究不同培養(yǎng)液對牛重構(gòu)胚發(fā)育的影響，本研究采用了CR1aa、mSOF和mSOF+FBS3種培養(yǎng)液對牛重構(gòu)胚進(jìn)行體外培養(yǎng)。3個(gè)培養(yǎng)體系都采用

8、卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，研究結(jié)果顯示mSOF組(39.52%)和mSOF+FBS組的卵裂率(40.96%)顯著高于CR1aa組的卵裂率(33.17%)，mSOF+FBS組和mSOF組之間卵裂率沒有顯著差異(P＞0.05)。mSOF+FBS組的囊胚率Ⅰ(36.76%)和mSOF組的囊胚率Ⅰ(36.36%)也顯著高于CR1aa組的囊胚率Ⅰ(31.34%，P＜0.05)。mSOF+FBS組的囊胚率11(36.76%)和mSOF組的囊胚率