甜菜堿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 探討甜菜堿對(duì)HUVEC的氧化損傷是否具有保護(hù)作用,探討HUVEC在氧化損傷條件下,甜菜堿對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響,對(duì)細(xì)胞中SOD活性和MDA含量及細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量的變化,揭示甜菜堿發(fā)揮作用的機(jī)制,為評(píng)價(jià)甜菜堿的藥用價(jià)值提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 應(yīng)用膠原酶消化灌注法提取原代HUVEC,采用形態(tài)學(xué)觀察和Ⅷ因子抗體免疫熒光檢測(cè)法相結(jié)合進(jìn)行鑒定,以確保內(nèi)皮細(xì)胞的來源準(zhǔn)確。細(xì)胞前

2、兩代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按如下分組進(jìn)行處理:(1)正常對(duì)照組;(2)H2O2損傷模型組:H2O2(H2O2的濃度為1mmol/L,);(3)甜菜堿低劑量組:甜菜堿(9.3mg/L)+H2O2;(4)甜菜堿中劑量組:甜菜堿(28mg/L)+H2O2;(5)甜菜堿高劑量組:甜菜堿(84mg/L)+H2O2;干預(yù)4小時(shí)后,應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察法和MTT法檢測(cè)各組血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖存活情況;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和AO、EB聯(lián)合染色法觀察各組細(xì)胞凋亡

3、的情況;應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的情況;利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中SOD的活性和MDA的含量以及細(xì)胞上清中NO的含量變化,以此分析甜菜堿保護(hù)HUVEC氧化損傷的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1培養(yǎng)的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng)細(xì)胞多為梭形或多角形,呈現(xiàn)特征性“鋪路石”樣排列。Ⅷ因子抗體免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到95％以上的細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光,表明培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)

4、皮細(xì)胞。
　　 2形態(tài)學(xué)觀察H2O2損傷組的細(xì)胞損傷明顯,細(xì)胞大面積的脫落,經(jīng)甜菜堿低、中和高濃度干預(yù)的細(xì)胞損傷情況有明顯的改善,并且隨著甜菜堿濃度的增高,細(xì)胞受損傷的程度越輕。MTT法結(jié)果表明,甜菜堿能明顯的抑制HUVEC的減少,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。
　　 3流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)甜菜堿中濃度和高濃度可以明顯的抑制細(xì)胞的凋亡,AO、EB雙染色的結(jié)果基本與流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致。
　　 4免疫熒光檢測(cè)甜菜堿

5、可以使氧化損傷細(xì)胞中的抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯增加而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯減少,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。
　　 5甜菜堿使氧化損傷的細(xì)胞中SOD的活性明顯升高而MDA的含量明顯降低,使細(xì)胞上清中NO的含量明顯增加。
　　 結(jié)論:
　　 1甜菜堿可以有效的抑制HUVEC的凋亡,保護(hù)HUVEC的活性。
　　 2甜菜堿抑制細(xì)胞的凋亡機(jī)制與提高Bcl-2蛋白的表達(dá)和降低Bax蛋白的表達(dá)相