JE疫苗突變株生物學(xué)特性及鴨坦布蘇病毒流行株基因特征研究.pdf

1、日本腦炎病毒（JEV）是人病毒性腦炎的主要病原。JEV可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的傳染病，且病死率較高，JEV同時也是馬致死性腦炎的主要病原，還會導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔和公豬的睪丸炎以及少數(shù)仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。JEV是一種自然疫源性病原，自然界中大部分脊椎動物都是其易感宿主，并主要在蚊子和豬之間傳播，其中三帶喙庫蚊是其主要的傳播媒介，豬是其主要的貯存和增殖宿主，鳥類也可參與其擴(kuò)增功能并在環(huán)境中參與病毒的長距離傳播。JEV是一種單股

2、正鏈的RNA病毒，是黃病毒屬JE血清群的原型病毒，其基因組編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒蛋白翻譯過程中，JEV NS2A基因上的七聯(lián)滑動體和下游的假結(jié)體結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致核糖體讀碼框的-1位移碼，進(jìn)而產(chǎn)生一個NS1衍生蛋白，NS1'蛋白。初步研究表明NS1'蛋白可能與病毒的神經(jīng)嗜性有關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù)驗(yàn)證了NS2A基因的第66位核苷酸是JEV表達(dá)NS1'蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)之一，同時闡明了NS1'蛋白不能顯著增強(qiáng)JE疫苗弱毒株的神經(jīng)

3、毒力，論證了分泌型NS1'蛋白可以作為檢測野毒感染的生物標(biāo)記。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白能夠抑制宿主的IFN-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　主要研究內(nèi)容為以下四個部分:
　　1.日本腦炎病毒E279對病毒蝕斑形態(tài)和神經(jīng)毒力的作用研究
　　乙型腦炎是一種由日本腦炎病毒引起的，廣泛流行于亞洲各個地區(qū)的病毒性腦炎。目前還沒有特異性針對乙型腦炎的治療藥物，主動免疫是在人群和易感動物中預(yù)防JEV感染的最有效的方法。本研究對商品化的

4、豬乙型腦炎和人乙型腦炎疫苗弱毒株進(jìn)行評估。結(jié)果顯示所有商品化疫苗均達(dá)到生產(chǎn)要求，JEV RNA拷貝數(shù)和病毒滴度均大于105每頭份。但是蝕斑形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)四株疫苗的蝕斑大小存在明顯差異，兩株豬乙型腦炎疫苗弱毒株在BHK-21細(xì)胞上蝕斑形態(tài)明顯偏小。全基因序列分析顯示突變主要發(fā)生在5'非編碼區(qū)扣E基因，并檢測到了幾個顯性突變位點(diǎn)，而兩株豬用疫苗弱毒株僅在基因組1813位有一個共同的顯性突變。全基因測序峰圖分析發(fā)現(xiàn)幾個核苷酸位點(diǎn)存在特異性的套峰

5、，說明所檢測的病毒在這些位點(diǎn)存在核苷酸的不完全置換。對兩株豬用疫苗株的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在E蛋白的鉸鏈區(qū)發(fā)生了關(guān)鍵位點(diǎn)的突變。通過對疫苗株進(jìn)行蝕斑純化，全基因分析以及疫苗回歸實(shí)驗(yàn)，闡明了JEV的E279由原來的蛋氨酸突變?yōu)橘嚢彼峥梢詫?dǎo)致病毒在BHK-21細(xì)胞上蝕斑形態(tài)的變小，論證了在BHK-21細(xì)胞上能夠顯著增加子代病毒的含量。乳鼠攻毒實(shí)驗(yàn)表明該位點(diǎn)的突變能夠顯著增強(qiáng)疫苗株對兩周齡乳鼠的神經(jīng)毒力。本研究發(fā)現(xiàn)JE疫苗株在病毒傳代

6、過程中容易發(fā)生關(guān)鍵位點(diǎn)的突變，為疫苗的安全生產(chǎn)和評估提供了有價值的信息。
　　2.JEV NS1'蛋白在疫苗弱毒株的產(chǎn)生機(jī)制及其在病毒感染中的作用研究
　　本研究首先建立了JEV弱毒株SA14-14-2的反向遺傳體系，并利用反向遺傳技術(shù)驗(yàn)證了JE血清群病毒表達(dá)NS1'蛋白的分子機(jī)制。NS1'蛋白是NS1蛋白在C端延伸52個氨基酸的衍生蛋白，是由于病毒在翻譯過程中發(fā)生讀碼框的-1位移碼引起的。JE疫苗弱毒株由于基因突變而廢除N

7、S1'蛋白的表達(dá)。本文通過回復(fù)突變NS2A基因的A66G可以恢復(fù)病毒NS2A基因的假結(jié)體二級結(jié)構(gòu)，促成了讀碼框-1位移碼的發(fā)生，并導(dǎo)致NS1'蛋白的表達(dá)。但是NS1'蛋白在BHK-21細(xì)胞上對病毒的復(fù)制效率幾乎不產(chǎn)生影響，動物實(shí)驗(yàn)表明NS1'蛋白不能顯著增強(qiáng)JEV弱毒株SA14-14-2的神經(jīng)毒力。然而，相對于不表達(dá)NS1'蛋白的病毒(rSA14-14-2)，表達(dá)NS1'蛋白的病毒(rA66G)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高的獲得性免疫應(yīng)答。此外

8、，NS1'蛋白可以從病毒感染細(xì)胞中分泌出來，在受感染動物的血漿中和受感染細(xì)胞培養(yǎng)的上清中均能檢測到分泌型NS1，蛋白，且NS1'蛋白只以二聚體的形式分泌到受感染細(xì)胞外。通過半定量分析發(fā)現(xiàn)，分泌到細(xì)胞外NS1'蛋白的數(shù)量與分泌的病毒粒子呈正相關(guān)性。雖然NS1'蛋白與病毒的毒力沒有明顯相關(guān)性，但是相比較JE疫苗弱毒株不表達(dá)NS1'蛋白，大部分的流行毒株可以表達(dá)NS1'蛋白。因此，分泌型NS1'蛋白可以代替病毒血癥作為生物標(biāo)記區(qū)分野毒感染和疫

9、苗接種。
　　3.體外模擬核糖體移碼機(jī)制及NS1，蛋白的亞細(xì)胞分布特征
　　NS1'蛋白是NS1蛋白在C端延伸52個氨基酸的衍生蛋白，是由病毒在翻譯過程中發(fā)生讀碼框的-1位移碼引起的。本研究通過體外模擬JE血清群病毒核糖體-1位移碼機(jī)制構(gòu)建了NS1'蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒。并應(yīng)用真核質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染12h后，就能檢測到NS1'蛋白的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染的早期，NS1'蛋白的表達(dá)存在時間依賴關(guān)系。真核表達(dá)的NS1'蛋白也

10、具有跨膜分泌的特性，也能夠形成二聚體的表現(xiàn)形式。對于真核表達(dá)的NS1'蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白均勻分布于BHK-21細(xì)胞的胞漿中，與NS1蛋白在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的分布沒有明顯的差異。
　　4.JEV NS1'蛋白對宿主IFN-β信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
　　本研究通過雙報告基因系統(tǒng)分析JEV NS1'蛋白對IFN-β啟動子活性的影響。首先，構(gòu)建了五個IFN-β啟動子活性域測試質(zhì)粒，并在PK15細(xì)胞上檢測其基礎(chǔ)活性和對

11、POLY(I∶C)刺激的反應(yīng)性。測試結(jié)果顯示，缺失IFN-β啟動子活性域Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ的兩個測試質(zhì)粒是失活性缺失，其幾乎不存在基礎(chǔ)活性，對POLY(I∶C)刺激的反應(yīng)性較低。而未缺失IFN-β啟動子活性域或缺失活性域Ⅳ，以及串聯(lián)4個活性域Ⅰ/Ⅲ的測試質(zhì)粒均有較高的基礎(chǔ)活性，且對POLY(I∶C)刺激具有良好的反應(yīng)性。通過與測試質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NS1'蛋白能夠抑制POLY(I∶C)刺激后IFN-β啟動子活性。并對其基礎(chǔ)活性也能產(chǎn)

12、生一定的抑制作用。此外，NS1'蛋白幾乎不能抑制真核表達(dá)的IRF7刺激后IFN-β啟動子活性。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了NS1'蛋白在PK-15細(xì)胞上能夠有效抑制POLY(I∶C)刺激后NF-κB的入核作用。通過病毒感染模型，闡明了在干擾素應(yīng)答的宿主細(xì)胞內(nèi)，NS1'蛋白能夠有效增加JEV的mRNA水平，并在感染早期抑制IFN-β的mRNA水平。通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在干擾素應(yīng)答的宿主細(xì)胞內(nèi)，NS1'蛋白可能與熱應(yīng)急蛋白、Vimen

13、tin和TRIM21發(fā)生相互作用，進(jìn)而抑制宿主的先天性免疫反應(yīng)。
　　5.鴨坦布蘇病毒流行株的全基因特征研究
　　鴨坦布蘇病毒(DTMUV)是一種可引起鴨產(chǎn)蛋量下降、采食量銳減，并導(dǎo)致部分感染鴨死亡的蚊蟲傳播的黃病毒。2011年，對我國安徽地區(qū)鴨坦布蘇病毒進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，從感染鴨群中分離出一株鴨坦布蘇病毒(DTMUV-AH2011)。通過序列測定和全基因分析顯示，DTMUV-AH2011分離株全基因?yàn)?1，064nt，含有

14、一個10，278nt的開放式閱讀框，在開放式閱讀框的5'端有94nt的5'NTR，開放式閱讀框的3'端有692nt的3'NTR。與其他5株坦布蘇病毒全基因相比，DTMUV-AH2011分離株的3'NTR有74nt的插入序列。通過對病毒編碼蛋白氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，近年來國內(nèi)分離的所有坦布蘇病毒均含有相對保守的多聚蛋白前體，氨基酸同源性在98.9％以上。除了NS4B蛋白沒有氨基酸置換外，其余蛋白均有氨基酸的隨機(jī)置換。對鴨坦布蘇病毒的生物學(xué)特